脂连接寡聚糖翻转酶的结构与催化机制

脂连接寡聚糖翻转酶的结构与催化机制镶嵌在膜中的脂类具有较大的极性头部基团，它们的翻转过程是缓慢的，并且极为不利的。因此，这一过程需要翻转酶来催化，但其催化机制却是未知的。一个关于翻转反应的著名例子是可在蛋白质的N连接糖基化作为供体的脂连接寡聚糖的转位。在空肠弯曲杆菌中，这一过程是由一种ABC转运体PGLK催化的。基于不同状态下的晶体结构，我们在此提出一个由PGLK催化的脂连接寡聚糖的翻转机制。在体外，PGLK能够运用内部和外部的构象，但是只有外部的构象才是催化翻转反应所需要的。当脂连接寡聚糖链的焦磷酸寡聚糖链头部基团进入了转位腔后，会与周边肽链上的正电荷发生相互作用；而脂质的多聚异戊二烯尾则结合并激活该转运体，但在翻转过程中，它仍位于脂双层中。我们所提出这种机制与适用于其他转运体的经典交替通路模型是有本质区别的。脂质从膜的一侧转至另一侧，被称为翻转，这不仅是维持膜的不对称性所必须的，而且也是许多生化过程的基础，比如说，信号传输、分泌和细胞内吞中的囊泡形成、膜蛋白活性的调节和蛋白质天冬氨酰残基的糖基化。在动物中，脂质双分子层两侧的不对称性影响着许多活动，比如说凝血作用、巨噬细胞识别过程和细胞凋亡。在细菌中，细胞壁成分的前体物质被耦联在脂质载体中，随着脂质的翻转而运出细胞外，这对细胞壁的形成来说是极其重要的。翻转反应是由主动的，或者说活跃的转运体蛋白所催化。这些蛋白包括通过消耗能量使得脂质在双分子层随机分布的爬行酶（SCRAMBLASES），由H或NA驱动的对向运输载体，和由ATP驱动的定向转运特定脂质的转运体。后者包括P4ATPASES和ABC转运体。尽管有了广泛的研究，但关于由翻转酶催化的脂质快速翻转反应的过程和机制仍然知之甚少。直到现在，只有细菌翻转酶的核心MSBA蛋白的晶体结构被报导公布出来，但是根据这点资料无法推断出任何相关机制。除了缺乏结构方面的资料外，可用于天然底物翻转反应研究的可靠体外试验分析也太稀少。原核生物翻转酶的一种主要底物是MAN5GLCNAC2PPDOLICHOL，一种脂连接寡聚糖（LLO），它可以从内质网膜的胞质一侧转移至网腔一侧，然后寡聚糖链被转移到新合成肽链的天冬氨酸残基上，从而形成蛋白质的N连接糖基化。在同源细菌的N连接糖基化途径中，一种化学结构类似的LLO（GLCGALNAC5BACPPUNDECAPRENYL）在人类致病菌空肠弯曲菌中出现了翻转。作为该过程的催化酶，PGLK是一种同二聚体的ABC转运体，并且在细菌蛋白质N连接糖基化过程中是必不可少的。在寡聚糖链转移酶PGLB作用下，已翻转的LLO的寡聚糖链部分被转移到受体蛋白质上；而十一异戊二烯焦磷酸盐部分然后在十一异戊二烯焦磷酸酶的催化下水解为单磷酸盐。为了探明由ATP驱动的LLO翻转反应的机制，我们研发出了体外分析方法，并测定出了空肠弯曲菌的PGLK在不同状态下的晶体结构。我们的研究结构揭示了这样一种机制只有PGLK的外部构象与翻转反应有关，从而在允许寡聚糖链穿过转运蛋白的情况下，而附着在PGLK表面的多聚异戊二烯尾仍然部分嵌在脂双层中。这一新提出的机制与用于解释目前研究的大多数转运蛋白催化机制的交替通路模型迥然不同。体外实验中PGLK催化LLO翻转和ATP水解的活性人们之前已经采用放射性同位素标记的天然脂质来研究多聚异戊二烯连接的寡聚糖的翻转过程。然而我们发现PGLK无论是在体外还是在体内，都可以催化寡聚糖链有所缩短的LLOS。于是，我们再重组PGLK和一种糖链部分为三糖的LLOS（TLLO），得到了一种蛋白脂质体。这种蛋白脂质体（FIG1A）有一个还原末端和两个N乙酰半乳糖胺（NACETYLGALACTOSAMINE，GALNAC）部分。此外，还使用了纯化的糖基转移酶PGLH。这种酶在空肠弯曲菌中的N连接糖基化过程有着重要作用，它可以使TLLO的非还原端最多加上三个GALNAC残基。我们借此来对位于蛋白脂质体外层可被翻转的TLLO进行放射性标记，以便可以准确测定由ATP驱动的、依赖于PGLK的TLLO翻转反应的速率。我们通过使用足量的UDPGALNAC，来确保每一个TLLO分子均被加上了三个GALNAC分子，以便能准确测定TLLO是否翻转到蛋白脂质体的内部（FIG1B。通过用纯化的寡聚糖链转移酶PGLB把结果中得到的寡聚糖链转移到荧光标记的受体多肽上，然后再进行SBSPAGE分析，从而证实了TLLO转变为六糖LLO这一过程。PGLK体外催化TLLO的翻转极度依赖于ATP的水解。PGLK中的WALKERB模体（E510Q）内的谷氨酸残基突变会使翻转速率下降100倍，这与观察到的体内催化活性下降是相一致的。在LLO存在的情况下，PGLK的ATP酶活性遵循MICHAELISMENTEN动力学，它的KM值为046008MM（MEANSD），与依赖ATP的TLLO翻转酶的KM值036003（MEANSD）相近。这证实了在驱动PGLK催化LLO翻转过程中，ATP的水解是必需的。和其他ABC转运体一样，结合天然底物可以促进水解ATP的速度。无论在去垢剂，还是在脂质体中，标准长度的LLO和TLLO都可以使PGLK水解ATP的速率提高约25倍，这表明天然LLO末端的GALNAC和支链上的葡萄糖残基与激活ATP水解和翻转活性无关。值得注意的是，尽管与野生型PGLK相比，E510Q突变体催化的水解和翻转速率都下降了几乎100倍，但ATP酶活性还是可以被LLO激活，这说明与LLO的相互作用不受E510Q突变的影响。与相关的多药ABC转运体不同的是，PGLK的ATP酶活性的激活是高度特异性的，如维拉帕米、HOECHST33342、罗丹明6G和盐酸吖啶黄等常用药物就没有任何激活作用。加入脂质A，被称为刺激因子MSBA，同样无效。不同状态下PGLK的结构我们测定了分辨率从29到59内的PGLK突变型E510Q的三种晶体结构（FIG2A）。其中两种是这种载脂蛋白的高分辨率结构图，并显示出了内部构象（分别编名为APOINWARD1和APOINWARD2）；而第三种是结合了ADP的PGLK的，这是一种全新的、胞外闭合（OUTWARDOCCLUDED）构象。鉴于后者有限的分辨率，我们在建模时借助了一个先前的发现ABC转运体跨膜部分的螺旋在发生构象改变时总是成对变化的。此外，我们还通过收集有关晶体和硒代半胱氨酸衍生物的反常衍射（ANOMALOUSDIFFRACTION）数据来证实所建立的模型。PGLK的折叠方式和其他ABC转运体相似，正如细菌ABC转运体SAV1866的结构所显示的那样。然而，PGLK含有一个额外的短螺旋（称之为螺旋“EH”）。EH处于细胞膜中，并与膜平面相平行（见下1）。我们使用十二烷基麦芽糖新戊二醇（LMNG）作为去垢剂，得到PGLK的晶体，从而获得APOINWARD1和胞外闭合结构；而APOINWARD2则是使用十二烷基D麦芽糖苷（DDM）作为去垢剂而获得的。三种晶体结构之间的联系是显著的，正如结晶情况所显示的那样。本项发现揭示去垢剂的种类和格子联系，而非蛋白质固有的性质，决定了内部构象中的核苷酸结合结构域（NBD）的分离程度。但相反的是，在对几种ABC转运体的核苷酸结合结构和数种分离的ABC结构域的观察中发现，在胞外闭合状态下的NBD排列酷似“封闭的两层三明治”。这三种PGLK结构之间的比较表明主要的构象变化包含了一种类似于剪刀样的运动，也就是说，跨膜螺旋TM4和TM5一起朝TM6运动，二者倾斜16（APOINWARD1VSAPOINWARD2）或者是50（APOINWARD1VSOUTWARDOCCLUDED）（FIG2B）。在细胞质周边区，PGLK的胞外闭合构象和SAV1866结构的整体外部构象不相同，因为存在着一个开向转运通道的开口。因此，胞外闭合PGLK可以在闭合状态的抗细菌肽的ABC转出体MCJD和全外部开放的SAV1866之间进行快速的构象改变外部螺旋EH在PGLKLLO相互作用中的作用连结PGLK的跨膜螺旋TM1和TM2的环包含外部螺旋EH（FIGS2AAND3A。而它的周边（与跨膜区域相关）由数个疏水作用、亲水作用和阳离子确定（FIG3A）。其结果就是，在靠近膜外边缘的地方，形成了两个疏水的沟分别位于EH和TM1、TM2之间（FIG3A）。鉴于它不寻常的位置和表面，我们通过研究体内外的PGLK突变来探寻EH之间的功能联系。我们产生了一个缺失突变（称为EH），EH的整个螺旋（残基S46P67）都被一段由八个氨基酸残基构成的灵活连接体所取代。此外，还产生了一个原有的TYR残基为ALA残基所取代的三突变体（Y50A/Y56A/Y63A，称为EHM1），和一个涉及稳定性的带正电荷的氨基酸残基突变的二突变体（R53A/K55A，称为EHM2）。当重组成脂质体后，这三种EH突变体表现出了和野生型一样的基础ATP酶活性。然而，LLO无法激活其ATP酶活性，这说明三种突变体已经失去了EH所具有的作用连结LLO，从而激活ATP酶活性（FIG3B）。在去垢剂中，EHM1和EHM2的基础ATP酶活性高于野生型的；然而EH的则略低于野生型的。然而值得注意的是，和在脂质体中一样，这三种突变体在去垢剂中，其ATP酶活性仍然不能为LLO所激活。和缺乏LLO激活ATP酶活性作用相一致的是，在体外实验中，EH催化下的翻转反应速度过低而难以被准确地测定出来；而EHM1和EHM2的则比野生型的低了1533倍（FIG3C）。而且，EH在体内中完全丧失催化活性；而EHM1和EHM2则显示出了只比野生型略低的催化速率（FIG3D）。我们应当注意到这样一点在体内因PGLK突变而造成的糖基化生物合成反应速度的下降不一定和体外实验中出现的翻转速度的下降直接相关，这是因为在体内中也许会存在着其他未知的限速步骤。一个相似的现象就是，PGLB的突变体在体外实验中，其催化糖基化的速度下降了两个数量级，或者更多；但是在体内中，只显示出来轻微的下降。据我们推测，在EH附近形成的疏水沟（FIG3A）也许有助于LLO结合到PGLK上。这样的一种相互作用可能会锚定LLO的脂质尾部，有利焦磷酸部分的定位，从而以便其进入转运穴之中，进而引发整个翻转过程。因为无法测定1译注原文此处下方为FIGURE2，显示了处于不同状态下PGLK的结构PGLK结合LLO时的结构，我们用人工合成的化合物代替结构上被截短了的天然LLO（FIG3E）。值得注意的是，截短了的LLOS都无法激活整合到蛋白脂质体中的PGLK的ATP酶活性。这也就说明了，缩短了的多聚异戊二烯尾（在GERANYLGERANYLPPGLCNAC中，最多为20个碳原子）也许会阻碍它们为位于脂双层中的PGLK所识别。相反的是，当在去垢剂中时，PGLK的ATP酶活性可以被法尼基焦磷酸（FPP）、FARNESYLPPGLCNAC和GERANYLGERANYLPPGLCNAC所激活。和在脂双层不同的是，在去垢剂中PGLK的ATP酶活性激活可能是因为同时结合了多个截短了的LLO分子。泛醌，一种具有和天然LLO相似的多聚异戊二烯尾、而头部完全不同的分子（FIG3E），无论是在去垢剂中，还是在脂质体中，均无法激活PGLK的ATP酶活性。这显示，多聚异戊二烯尾和焦磷酸部分都为LLO和PGLK高效的、可激活ATP酶活性的相互作用所必需。当使用天然的LLO时，我们发现了ATP酶激活的正协同作用（KMLLO8208M；HILLCOEFFICIENTNH1904），这与PGLK的表面有两个可与LLO分子相互作用的区域有关。内部穴和外部穴的功能PGLK结构的内面有一个比较大的穴，它面朝细胞质，并且通到了脂双层的内面（FIG4A）。在其他无核苷酸结合、面向内部状态时ABC转运体中也发现了相似的穴，它们被认为是底物结合部位。于是，也许有人会推测，在LLO翻转过程中，由55个碳原子构成的多聚异戊二烯尾从脂双层中折叠（或者说“卷曲”）进入了疏水的内部穴中（FIG4A）。尽管这难以与EH协助LLO相互作用中的必要属性相一致，但我们还是探讨了这一假想，并且在PGLK的每个亚单位中（S294F/V297W）各插入了两个大的氨基酸残基，从而使得内部的疏水穴的体积减少了大约60。这种突变体无论在体外还是体内，都保持着和野生型一样的翻转速率和ATP酶激活特性。这也就反驳了内部的穴参与多聚异戊二烯结合过程，并说明多聚异戊二烯尾在翻转过程中仍然是保持在时脂双层中。我们接下来考虑是否是焦磷酸寡聚糖链头部基团在翻转过程中被转运到了内部的穴。然而，这似乎是极其不可能的，原因是作为ABC转运体功能区切换的结果，PGLK每个亚单位中的TM4TM5相互交叉，并且结合与之相对的亚单位上的NBD。由内面结构所形成的穴因此也就由TM4和TM6来确定（FIG2B）。如果LLO的焦磷酸和寡聚糖链部分进入了这个穴中，LLO分子会在翻转过程中被“掐断”，因为TM4和TM6之间的间隙会关闭，而一个新的开向外面的间隙（TM1和TM3之间）会打开。这会困住LLO分子，并且产生严重的原子空间碰撞，从而阻碍底物的释放。基于以上的考虑，不可避免地会得出这样一个结论在PGLK催化的翻转过程循环中，内部的穴并不参与LLO的结合。外部穴与内部穴在化学属性上完全不同。翻阅以前的研究，我们基于SAV1866构建了一个完整的PGLK的外部穴的结构。这一模型具有一个和胞外闭合结构相似的穴，但有一个更大的开向细胞膜胞质一侧的开口（FIG4A，B）。在两种状态下，外部的穴几乎跨过了整个细胞膜，并且虽然向胞外闭合部分无法提供充足的空间来容纳LLO的焦磷酸和寡聚糖链部分，但是整个外部空间却可以。我们确定了排列在外部穴内面的多个ARG残基（R86，R260，R302和R309）共产生了八个正电荷（FIG4B）。由于在ABC转运体从朝内状态变为朝外状态的剪切运动，这些ARG被包埋，在朝内构象时形成盐桥；但是当PGLK变为朝外构象或者向胞外闭合时，却暴露出来。因为ARG也许会参与LLO的焦磷酸部分的结合，我们产生了每个位点的单个ALA替换突变（R86A，R260A，R302A和R309A）和一个所有电荷都缺失了的四位点的突变。虽然单位点突变体在体内和体外仍然具有一定程度的催化翻转活性，但是，四位点突变体无法催化LLO翻转（FIG4D，E）。而且，虽然单位点突变体的ATP酶活性可被LLO一定程度的激活（尽管基础ATP酶活性有所下降），但是四位点突变体的ATP酶活性却无法被激活（FIG4C），这也就说明了LLO和突变型PGLK之间的相互作用有了明显的下降。翻转机制日积月累的生化和结构资料让我们提出了一个PGLK催化LLO翻转的机制，如FIG5所示。PGLK与催化活性相关的两种构象分别称为向胞外闭合构象（ADP结合状态）和朝外构象（ATP结合状态）。鉴于细胞内的ADP和ATP浓度只有微摩级，转运体的分离状态，以一种朝内结构为代表，可能是短暂而稀少的。ATP和ADP之间的快速交换，不会允许同二聚体蛋白PGLK的所有ATP结合部位同时处于一种未结合核苷酸的状态。我们提出这样一种假设，当LLO的多聚异戊二烯尾与PGLK表面的EH及其周边相互作用时，其焦磷酸部分直接进入ATP结合状态时的外部穴中，并与ARG残基之间产生静电作用。而寡聚糖链部分则跟随焦磷酸部分，但在转运过程中不需与PGLK产生任何特定的相互作用。这也就能够解释翻转反应对多糖长度的低选择性或者低特异性。这一假说与观察到PGLK可转运通常由MOP（MULTIDRUG/OLIGOSACCHARIDYLLIPID/POLYSACCHARIDE）型翻转酶WZX所转运的不同的LLOS。这也可以说明相关的ABC型翻转酶是如何在菌体抗原产生过程中转运长的、直线型的高聚糖链因为延长了的寡聚糖链被想象为直接滑进面向外部的转运路径中，然后停留在外表面，所以不存在对糖连长度的限制。在我们的模型中，PGLK催化翻转反应的驱动力来自两个方面。首先，在转运过程中，ATP水解会导致NBDS被迫分开（以便于产物释放），这一运动传到TMDS后会产生一种施加于底物上的压力。这也许会让人回想起维生素B12ABC转运体催化机制中提出的蠕动转运部分。其次，一旦焦磷酸和寡聚糖链部分已经扩散到