a33启动子介导的溶瘤腺病毒携带il24对结肠襄癌的抗癌作用研究（可编辑）

A33启动子介导的溶瘤腺病毒携带IL24对结肠襄癌的抗癌作用研究浙江理工大学硕士学位论文浙江理工大学学位论文原创性声明本人郑重声明我恪守学术道德,崇尚严谨学风。所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写,我对所写的内容负责,并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名日日期年月学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口,在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密口。学位论文作者签名指导教师签名日日期年月日期年月浙江理工大学硕士学位论文启动子介导的溶瘤腺病毒携带对结肠癌的抗癌作用研究摘要随着社会的发展和科学的进步,很多疾病已经能够治愈,恶性肿瘤则成为人类致死的头号杀手,是国际科研领域内投入最多、研究最深入的疾病之一。结直肠癌,作为人类高发恶性肿瘤,其发病率一直呈上升趋势。在我国,结直肠癌死亡率已位于恶性肿瘤死亡率的第五位,严重危害人类健康。年,刘新垣院士提出的“癌症的靶向基因病毒治疗这一新型肿瘤治疗策略,不仅解决了病毒在肿瘤内特异性增殖问题,而且融合了治疗基因协同杀伤肿瘤的双重优势。溶瘤腺病毒载体的靶向性和携带出色的肿瘤治疗基因是该策略发挥最佳疗效的关键。腺病毒复制最重要的元件是其区,特别是区,本课题正是利用改造区序列,将区的碱基删除,贝。,蛋白质不能与结合,抑制了细胞周期并促进病毒在肿瘤细胞中选择性地复制。黑色素瘤分化相关基因/白介素/作为一种出色的肿瘤治疗基因,具有多功能调节并诱导癌症细胞死亡的作用,由于它对肿瘤杀伤选择性高并对正常细胞没有毒害的特点而被用于本课题中。研究发现,人胃肠道上皮细胞表面的一种跨膜糖蛋白抗原具有很高的肠组织特异性,它已成为临床上单抗靶向治疗结肠癌研究的热点,而进一步研究其基因表达调控就有重要意义。这不仅可以从分子水平上阐明基因组织特异表达的机理,而且通过此研究还能为结肠癌基因靶向治疗提供一种新思路。本课题首先构建一个由启动子调控的双靶向结肠癌特异性增殖溶瘤腺病毒载体,再在此基础上携带一个抗癌基因,构成我们策略中提到的靶向基因病毒,以期能够取得很好的抗结肠癌效果。实验结果表明一有一定的肿瘤杀伤能力,并对正常细胞毒副作用非常小,但对五种结肠癌细胞的杀伤作用并未明显高于其他四种肿瘤细胞。启动子调控的重组溶瘤腺病毒一在感染复数浙江理工大学硕士学位论文为时对肿瘤的杀伤效力并不强,在感染复数为时,九种细胞中存活率最低也仅为左右。结果也显示目的病毒比载体病毒一对肿瘤的杀伤作用并没有明显增强。结果说明,启动子调控重组腺病毒体外抗结肠癌特异性不明显,启动子活性不高。启动子活性及其调控机制有待进一步研究,从而改进实验思路,为结肠癌的靶向基因病毒治疗提高新的方案。关键词启动子基因靶向基因病毒治疗溶瘤腺病毒结肠癌浙江理工大学硕士学位论文。一,曲,”,/一/,晰,印,浙江理工大学硕士学位论文,一,一一,浙江理工大学硕士学位论文缩略词缩写英文全称中文全称浙江理工大学硕士学位论文目录摘要缩略词目录第一章启动子介导的溶瘤腺病毒携带对结肠癌的抗癌作用研究弓言缮直肠癌治疗的研究进晨,溶癯隙病毒在恶性髀瘤治疗韵研究进震基因在结肠癌靶向基因病毒治疗的应用蟹述细菌内同源重组法锄备腺病毒实验的的和意义,创新有。,实验材料,菌钴与赁慰,职唇毛瑟兰皇纪击瓤,喾历罗荔多/夕弘,扇劲潜茄鲈,角嗍堂钴,主要实验绽器,主己要勺努勺翊爱笳影,实验方法重组质粒的构建细菌内重组及鉴定重组骤病毒的小量扩增及鉴定病毒的大量扩增与纯化力萝香痂莎盎乎夕女毫,检溯及蛋白水平的表达溶瘤豫病毒体外抗瘤效果评价艿纺才学分析实验结果及分析。中间载体硼的鉴定结果穿旋赁慰,的鉴宕。穿梭质粒的签定匆廖访童组缯祭签定重组骥疬毒卅的鉴定寓动子能有效驱动重组病毒早期基因蛋白在睁瘤细咆中的表达,封在肿瘤细胞中能有效表达蛋白。重组病毒鲍”具有一定的抗睁瘤能力。抗肿瘤谱宽广并且安全性高浙江理工大学硕士学位论文坦苑绕励癌唠鼻雒不够星讨论与展望。第二章溶瘤腺病毒联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导结肠癌细胞凋亡引言组蛋白去乙酰化抑翻荆对肿瘤治疗研究现状。及靶向基爱孓病毒治疗策略、联合治疗肿瘤构想实验的的和意义,始鳜有实验材料实验方法,角嗍鲂劈券钻胛毒定验结晶紫染色进行细胞毒性分析荣彦魔察黝滑亡钻流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡率橙调鳓诒内尼的矛迭。纺矛学必理。实验结果盯法进行病毒药物各处理组细跑毒性检测结晶紫实验分析联合对凋亡的影响染色观察各处理组细胞凋亡现象伊法检灏细胞早晚期凋亡检铡目的基因蛋白水平的表达。讨论与结论参考文献致谢硕士研究生期间发表论文浙江理工大学硕士学位论文第一章启动子介导的溶瘤腺病毒携带对结肠癌的抗癌作用研究引言结直肠癌治疗的研究进展随着社会的发展和科学的进步,很多疾病已经能够治愈,恶性肿瘤则成为人类致死的头号杀手,是国际科研领域内投入最多、研究最深入的疾病之一。结直肠癌,作为人类高发恶性肿瘤,其发病率一直呈上升趋势,统计数据显示,在南美洲、东欧、亚洲的大部分发展中国家,年的结肠癌发病率比年有大幅的升高,其中男性患者的升高更为显著【】。结肠癌在全球的男性癌症患者中位居第四而女性患者中,更是高居第一】。我国结直肠癌死亡率已位于恶性肿瘤死亡率的第五位,严重危害人类健康。结肠直癌的发生与饮食、环境、遗传等密切相关。在我国,随着人民生活水平的提高以及高蛋白、高脂肪、低纤维素的饮食结构的改变,结肠癌发病率和死亡率呈逐年上升的趋势,发病年龄明显减小【,在肿瘤死因排序上提前【。结直肠癌的发生是多种癌基因协同作用的结果,涉及多种癌基因如原癌基因及抑癌基因的多个阶段。结肠癌的转移与转移基因激活或转移抑制基因失活有关,也是多种转移相关基因及转移抑制相关基因综合作用的结果。当癌基因与抑癌基因之间的平衡被打破,控制细胞增殖的癌基因持续或过高表达,同时抑癌基因不表达或失活时,便会使癌变细胞逃避机体免疫机制的控制,形成肿瘤【】,进而导致细胞的恶化及转移。近年来结肠癌的诊断、治疗取得了一些进展【,但主要的疗效还是主要源于结直肠癌患病早期的手术治疗,但手术治疗并不能阻止结肠癌复发的危险。期和期的结直肠癌患者术后的预后情况良好,临床治愈率高达,但是一旦肿瘤组织发生浸润并穿透了浆膜层或者出现了淋巴结转移,患者的预后水平则显著下降,五年生存率仅为【】。而对于放疗而言,在浙江理工大学硕士学位论文杀死肿瘤细胞的同时,也给人体正常细胞带来了严重损伤,具有极大的副作用。另外由于肿瘤会对分子结构不同、作用机制各异的抗肿瘤药物产生交叉耐药性,其极大限制了化疗药物的疗效,。因此一些新的疗法如病毒治疗和基因治疗等引起了人们的关注。想要安全、有效地用这两种方法进行治疗,寻找具有高度组织特异性的靶向目标成了关键。最近在人肠组织中发现了一个非常有潜力的候选者抗原【】。由于蛋白的表达具有很高的肠组织特异性,它已成为临床上单抗靶向治疗结肠癌研究的热点,而进一步研究其基因表达调控就有重要意义。这不仅可以从分子水平上阐明基因组织特异表达的机理,而且通过此研究还能为结肠癌基因靶向治疗提供一种新思路。溶瘤腺病毒在恶性肿瘤治疗的研究进展近百年来,偶尔会出现肿瘤病人被病毒感染后肿瘤暂时性消退的现象,这一现象引起了肿瘤生物学家的关注【。上世纪五十年代科学界曾有人提出病毒治疗肿瘤的设想,即利用各种病毒的细胞毒性杀死肿瘤细胞。七十年代初,研究人员已发现有种对肿瘤具有治疗作用的病毒,并开始进行临床试验。九十年代初首次描述了他们所构建的病毒能选择性消灭肿瘤细胞【】。年,提出“病毒治疗”的概念。多种复制选择性溶瘤病毒在临床上被深入研究如来源于腺病毒的、/、,来源于新城疫病毒的】等。目前至少有种病毒治疗方案已经或者不久将进入临床实验。通过基因工程技术将病毒基因组进行改造,可实现选择性的在肿瘤细胞中复制、增殖,导致细胞裂解,释放出子代病毒扩散到邻近的癌细胞中,在肿瘤组织内引起一系列连锁反应,最终消灭肿瘤,而在正常细胞内病毒的复制和杀伤能力减弱甚至消失,这种经过改造的病毒被称为肿瘤特异性增殖病毒,或者溶瘤病毒【,目前已上市成为世界上第一个正式进入临床应用的溶瘤病毒生物制剂。在病毒治疗中,由于腺病毒由于具有宿主范围广,病毒滴度高,对人的致病性低,基因结构与功能研究比较清楚,容量大,易于插入大片段的外源基因,甚至能同时表达多个治疗基因等多种优势,因而是应用最为广泛的病毒载体之一。但是由于病毒在某些肿瘤细胞并不表达病毒受体,病毒在瘤体内的复制能力受到浙江理工大学硕士学位论文限制,以及宿主细胞的免疫排斥等原因,单独使用病毒进行治疗效果并不理想。刘新垣院士结合基因治疗和病毒治疗的优势于年正式提出了一种新型的肿瘤治疗策略,即“癌症的靶向基因一病毒治疗策略【。这种策略既克服了传统的肿瘤基因治疗转染率低、靶向性差、抗癌基因表达量低以及溶瘤病毒杀伤力不足等缺点,更融合了病毒在肿瘤内特异性增殖和治疗基因协同杀伤肿瘤的双重优势,达到了溶瘤病毒和治疗基因协同杀伤肿瘤的目的,为肿瘤治疗开辟了新的途径。越来越多的研究表明溶瘤腺病毒是目前基因病毒治疗领域中应用前景最好的抗癌病毒载体。经过改造后的溶瘤腺病毒可以有效的介导外源治疗基因在特定的肿瘤细胞内表达。总结临床和肿瘤的基础应用实践,通常对溶瘤腺病毒有以下改造策略第一删除腺病毒在正常细胞和组织中对其复制必须而在肿瘤中复制不必须的基因,如删除基因的腺病毒】和,这些病毒能够有效地靶向肿瘤细胞,选择性地在肿瘤细胞内复制,还有删除的等使突变的溶瘤腺病毒能够特异地靶向癌细胞内异常的/信号通路筮可。第二在转录水平上,用肿瘤或组织特异性启动子替代腺病毒原来的启动子用于调控重组腺病毒载体的早期必需转录基因,如,基因,使重组腺病毒只能在该特异性启动子阳性激活的癌细胞中选择性复制。第三改造腺病毒的外壳蛋白,提高腺病毒特异性的嗜性,从而使病毒特异地靶向肿瘤细胞,如在腺病毒的外壳蛋白的区段人为地插入一段对肿瘤细胞具高亲和力的多肽,如,使得腺病毒对肿瘤细胞的感染率大大提高。腺病毒复制最重要的元件是其区,特别是区,本课题正是利用改造区序列,将区的碱基删除,则。,蛋白质不能与结合,抑制了细胞周期并促进病毒在肿瘤细胞中选择性地复制。同时用肠组织特异性启动子启动子代替本身的启动子,变成。上述构建物即为双靶向溶瘤腺病毒载体,此腺病毒理论上靶向结肠癌细胞并具较高的安全性。浙江理工大学硕士学位论文基因在结肠癌靶向基因病毒治疗的应用黑色素瘤分化相关基因/白介素/是一个具多功能调节并诱导癌症细胞死亡的细胞因子,由于它对肿瘤杀伤选择性高但对正常细胞没有毒害的特点,几基因常应用于肿瘤的基因治疗,是一个公认而出色的肿瘤治疗基因。白细胞介素,有时也称黑色素瘤分化相关抗原,由激活的单核巨噬细胞和淋巴细胞产生。基因由个外显子和个内含子组成【】,其全长为,主要阅读框架编码了一个个氨基酸组成的新蛋白,分子量为。蛋白是一种螺旋的分泌蛋白,参与的信号途径复杂,目前已经研究较为清楚的相关信号如下图。图涉及的信号网络研究表明用腺病毒载体过表达能杀伤多种肿瘤细胞,如黑色素瘤、多形性胶质细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肺癌、鼻咽癌、前列腺癌,但对正常细胞无影响【】。等将携带基因的复制型腺病毒转浙江理工大学硕士学位论文染于无胸腺裸鼠中的乳腺癌细胞,发现几不但对原移植的癌细胞起杀伤作用,而且对远处转移的癌细胞也有杀伤作用。其抗肿瘤效果远比的作用强。】等用溶瘤腺病毒转染正常的细胞,未发现其溶细胞效应而诱导在转染结肠直肠癌细胞株时,发现其通过激活和,的表达来诱导靶细胞凋亡。与应用或转染结肠直肠癌细胞株相比较,产生了更强的抗肿瘤作用。紧接着】等又在荷瘤裸鼠研究中发现,对肿瘤有极大的杀伤力,联合和在短时间内能使荷瘤裸鼠肿瘤全部消退,两者共用较低的病毒用量。由此可见,是个临床应用价值巨大的抑癌基因。目前和已经进入临床期前的毒理安全评价实验阶段。本课题根据上述这些背景做了如下设计首先构建一个由启动子调控的双靶向结肠癌特异性增殖溶瘤腺病毒载体,再在此基础上携带一个抗癌基因,构成我们策略中提到的靶向基因病毒,以期能够取得很好的抗结肠癌效果。概述抗原【】是在人胃肠道上皮细胞表面的一种跨膜糖蛋白,作为免疫球蛋白超家族中一种新的细胞表面受体或细胞粘连分子,其表达具有很高的组织特异性。蛋白己作为一种肠上皮组织的标志物分子,主要分布于肠粘膜上皮细胞的基底部与细胞囊泡内。】等在发现它在的原结肠癌和转移型结肠癌中过表达,在的胃癌和的胰腺癌中表达,但在大多数其他组织和肿瘤中少有表达。目前国内外已对组织特异性表达机制进行了不少的研究,并已将抗原列位胃肠道肿瘤抗体靶向治疗的主要靶点之一。由于基因表达的高组织特异性,故其抗原已成为临床上单抗靶向治疗大肠癌研究的热点。】。上述研究说明,跨膜糖蛋白的启动子应用于靶向基因病毒治疗平台,可能在结肠癌细胞中具有很好的组织特异性。浙江理工大学硕士学位论文细菌内同源重组法制备腺病毒重组腺病毒制备的关键是同源重组和对重组体的筛选及鉴定。传统的病毒制备方法如“细胞内同源重组法等,存在成功率低、工作量大、实验周期长等缺陷。因此,本研究采用了细菌内同源重组法快速构建重组腺病毒质粒。细菌内同源重组法最早由等提出,完善于等。载体系统是目前应用较为广泛的商业化细菌内重组腺病毒包装系统。该系统主要利用一个穿梭质粒和一个包含腺病毒大部分序列的大质粒之间同源重组的方法,构建出有感染力的病毒。只需如下二步先将表达盒装入穿梭质粒载体,然后再插入腺病毒基因组。载体系统中,含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒,而不是线性,并且同源重组则在大肠杆菌进行。相对于传统系统而言,这二点改进使病毒操作更容易,同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。在本系统中,首先将基因表达框插入穿梭质粒载体,将得到的重组质粒用线性化,然后在大肠杆菌中与病毒质粒进行同源重组。缺失了和区,其区功能将在细胞中得到互补。若补回区,系统同样也可以用于复制型腺病毒的包装。重组子通过卡那霉素筛选,用内切酶进行鉴定分析。最后将得到的鉴定正确的重组质粒用线性化,线性化的目的是切掉重组子的原核表达元件,同时其反向末端重复序列,也被暴露出来。转染细胞后产生重组病毒颗粒。与传统系统相比,系统中筛选和纯化腺病毒所需的时间大大缩短。由于其在细菌内重组的优点,通过体外鉴定出正确的重组子,使得通过系统包装出的腺病毒基本不会有野生型的污染。同时,采用细菌内同源重组法,也使重组腺病毒的制备对细胞生长状态的依赖及对其传代次数要求明显降低,从而进一步降低了操作难度,消减了成本【。与传统的细胞内腺病毒包装的原理一样,系统包装腺病毒也是通过大小质粒之间的同源重组。其小质粒主要有两种,和,大质粒为。见下图浙江理工大学硕士学位论文璐筠秘枷柳只醋船,嘲姗鳃雄,轴辨结弹,罄秘潞懵嚣啪图细菌内重组所需质粒图谱简图系统包装腺病毒流程可以分为三个部分将目的片段连入或,做好穿梭载体的构建。系统中有种转移载体可供进行重组腺病毒构建和,这个载体都含有多克隆位点供插入基因。不含有启动子和多聚腺苷酸位点,允许插入含特定启动子和位点的表达盒。含有单拷贝启动子和位点供基础表达和高表达重组蛋白,只需将目的基因插入的多克隆位点。将构建好的穿梭载体用线性化后转入感受态中。在转化之前必须确证所列的线性化位点不存在于插入的基因中。有时候也可用来进行线性化。如果插入基因含有所有线性化酶切位点,那么必须进行定向突变。筛选的重组子用线性化后,转染细胞。浙江理工大学硕士学位论文实验的目的和意义构建携由启动子调控的带人基因且删除区的溶瘤腺病毒,研究其体外对结肠癌癌细胞生长的抑制作用。这一研究的实施,有助于阐明结肠癌发生发展中的分子生物学机制,为筛选抑瘤药物提供新的分子靶点及相关评估资料,也可以为有效地预防和治疗这一严重危及人类生命的恶性肿瘤提供理论依据。创新点肿瘤特异性增殖腺病毒即溶瘤腺病毒,是目前最具前景的靶向基因治疗载体之一。因单靶向溶瘤腺病毒的特异性还不够强,我们又构建了双靶向溶瘤腺病毒载体。腺病毒复制最重要的元件是其区,特别是区,本实验室已将区的碱基删除,则。蛋白质不能与结合,抑制了细胞周期并促进病毒在肿瘤细胞中选择性地复制。同时我们用具有肿瘤特异性启动子启动子代替本身的启动子,进行靶向治疗结肠癌的体外研究。上述构建物简写为。,即为双靶向溶瘤腺病毒载体,此腺病毒理论上能很好的靶向结肠癌细胞并具较高的安全性。实验材料菌株与质粒菌株和、在基因保守区缺失的质粒、穿梭一和质粒均由本实验室保存。大肠杆菌质粒和质粒来自于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。工具酶及生化试剂实验中所用到的工具酶及生化试剂如表所示浙江理工大学硕士学位论文表工具酶及生化试剂生化试剂购置公司碱性磷酸酯酶公司限制性内切酶公司公司酶胶回收试剂盒公司产物回收试剂盒公司公司公司试剂盒连接酶公司公司聚合酶蛋白酶、酶【公司胎牛血清、小牛血清、公司公司琼脂糖、溴化乙锭公司琼脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物氢氧化钠、蔗糖公司饱和酚上海生工生物工程公司氯仿兰溪双林化工有限公司氯化铯、上海生工生物工程公司氯化钙、氯化钠杭州汇普化工仪器有限公司无水乙醇、醋酸钠、异丙醇杭州长征化学仪器有限公司磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾杭州屹达化工有限公司合成引物序列依据引物设计原则,采用软件获得较佳的引物序列,并由上海英骏公司负责合成,使用前配置成/“。本实验采用引物如下启动子鉴定引物序列浙江理工大学硕士学位论文表达框鉴定用引物序列野毒鉴定缺失引物序列腺病毒是区缺失,由启动子调控表达蛋白的非复制型腺病毒,为本实验室保存。和几一。分别为本实验室构建的启动子调控的载体病毒和携带治疗基因的靶向性溶腺病毒。抗体公司,购自公司,购自抗体购自公司,抗体购自公司。细胞株本课题所用到的所用细胞株如表所示表实验选用细胞株来源名称细胞类型培养性质及条件一、肿瘤细胞株人宫颈癌细胞株细胞库人肝癌细胞株细胞库人肝癌细胞株细胞库人肺腺癌细胞株细胞库人结肠癌细胞株细胞库人结肠癌细胞株细胞库浙江理工大学硕士学位论文人结肠癌细胞株细胞库匣人结肠癌细胞株细胞库人结肠癌细胞株细胞库匣二、正常细胞株人肝细胞株细胞库人肺纤维细胞株细胞库三、腺病毒包装腺病毒转化的人胚肾细胞株主要实验仪器实验中所用到的主要实验仪器如表所示表主要实验仪器型正置荧光显微镜奥林巴斯公司型公司红外激光成像系统高速冷冻离心机日本超速冷冻离心机德国二氧化碳培养箱型德国公司台式低温离心机贺利氏/荧光倒置显微镜日本奥林巴斯髓稳压稳流电泳仪天能型自动蒸发消毒柜公司梯度仪型美国紫外分光光度仪日本水平电泳槽天能生物安全柜超低温冰箱凝胶成像仪/浙江理工大学硕士学位论文生化培养箱上海一恒公司倒置显微镜重庆光仪鼓风干燥机型上海一恒公司纯水系统型公司电子天平型赛多利斯公司空气摇床型仪型型美国酶标仪细胞流式仪转移仪型公司液氮罐主要溶液配制本课题试验中用到的主要溶液及其配置方法如表所示表主要实验溶液溶液种类配制方法培养基蛋白胨/,酵母膏/,氯化钠/三种成份溶于去离子水中,用调至,加,。水定容至高压灭菌琼脂糖凝胶缓冲液中,微波炉加称取琼脂糖溶于热溶解后冷却至一左右,加入/溴化乙锭溶液混匀至浓度为,再将其倒入准备好的凝胶板中冷却待用。根据需要分别配置小孔、中孔、大孔胶。溶液葡,萄糖。溶液,。溶液,冰乙酸,浙江理工大学硕士学位论文透析缓冲液将蔗糖,为的液,溶液定容至。缓冲液和用蒸馏水溶解,用调值至,用蒸馏水定容至。胰蛋白酶消化液工作浓称取胰蛋白酶、粉末,用度溶液溶解,微孔滤膜过滤除菌。将溶解后加入终浓度为/青霉素、谷氨酰胺,过滤,然后加入终体/链霉素和积/的。丙烯酰胺贮存液称取甲叉双丙烯酰胺,加双蒸丙烯酰胺,水溶解定容至,装入棕色瓶中。保存。/称取溶于双蒸水,用浓盐酸调至,定容至,。保存。/称取溶于双蒸水,用浓盐酸调至。,定容至,保存。通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺,和,亚甲丙烯酰胺的聚合。四甲基胺/过硫酸铵称取过硫酸铵,定容到去离子水中,最好现用现配。称取溶于的双蒸水中,用磁力搅拌/十二烷基硫器搅拌直至完全溶解,用双蒸水定容至。酸钠,甘油上样缓冲液为,溴酚蓝,为还原性条件,非还原性条件不加,加双蒸水定容至,分装。保存。还原型上样配方为/为,/二缓冲液硫叔糖醇加,加,溴酚蓝加,甘油加。,甘氨酸电泳称取,甘氨酸,加入缓冲液加双蒸水溶解定容至。浙江理工大学硕士学位论文分离胶/超纯水,/,为,过硫酸胺。/层积胶超纯水,/,为,过硫酸胺,加。电转缓冲液碱,甲醇,溶于双蒸水,甘氨酸,加双蒸水至。溶液用蒸馏水溶解,碱,用调节值至,加蒸馏水至。高压蒸汽灭菌后使用。溶液在中加入。封闭液溶于中。,。溶液实验方法重组质粒的构建本课题重组质粒一是在质粒砷、和的基础上进行构建的。主要涉及常用分子克隆实验方法如下一、质粒的小量抽提菌体扩增接种环挑取平板上的单胞菌落,接种到含相应抗生素的液体中,在摇床上培养过夜。茵体收获取大约细菌培养物,转移至离心管中,离心。吸去培养液后,将沉淀重悬于冰上预冷的溶液中,剧烈振荡至菌体完全混匀。浙江理工大学硕士学位论文。加入新配制的溶液,快速颠倒混匀次,室温静置。加入山冰预冷的溶液,轻微振荡至均匀,冰浴,离心,小心吸取上清至另一个管中。加入等体积酚氯仿,振荡混匀,离心,将上清转移至另一个管中。加入倍体积无水乙醇,摇匀,室温静置,离心,弃上清。乙醇洗涤沉淀,吸干离心管中液体,室温至乙醇挥发干净。加入溶解沉淀并使降解。置于加入,水浴冰箱中保存备用。二、电泳与回收待琼脂糖凝胶凝固后,在加样孔分别加入酶切产物及,电泳后,进行切胶。紫外灯下用干净的手术刀快速割下含目的的琼脂糖凝胶块,放入离心管中,电子天平称重。用凝胶回收试剂盒回收目的片断。按比例加入倍凝胶体积量的,混匀后,加热融化。/倍体积量的向胶块融化液中加入,混合均匀。将试剂盒中的离心柱安置于回收管上,将混合液转移至离心柱中,离心,弃掉虑液。将的加入离心柱中,离心,弃掉虑液。将的,弃掉虑液。加入离心柱中,离心重复步骤操作一次。将离心柱安置于新的管上,在离心柱的膜中央处加入的灭菌水,室温静置。,离心洗脱,取进行电泳检测。电泳正确后,于保存备用。三、产物片段的回收与鉴定,然后于加样孔分别待胶凝固后,在产物中加入适量的加入产物及样品,电泳,凝胶成像仪初步判断产浙江理工大学硕士学位论文物,凝胶回收试剂盒切胶回收取管预称重,切下目的片段放入已称重管,再次称重,获得凝胶纯重,加入倍凝胶质量的,混匀后加热融化。向上述胶块融化液中加入/体积量的,均匀混合。将试剂盒中的离心柱安置于回收管上。将混合液转移至制备管,离心,弃虑液。加入,弃滤液。加,弃虑液。重复前一步骤一次。空,转,将离心柱安置于新的管上,在离心柱膜的中央处加入的灭菌水,室温静置。离心洗脱,取山电泳检测。电泳正确则放于保存备用。四、酶切连接线状质粒的去磷酸化用限制性酶酶切约腭质粒,琼脂糖凝胶电泳并回收得质粒。加入小牛碱性磷酸酶,和山,加水至山,混合均匀。将混合物置于水浴琼脂糖凝胶电泳后回收去磷酸化的片段。目的片段和载体的连接通常连接反应体系体积为山。先加入/总体积的连接,再加入一定量的根据要插入片段大小及载体浓度高低而定量,其摩尔比约为,加入“连接酶后,补加一定量的无菌双蒸水至总体积为肛,混合均匀,放于的保温瓶内,水浴过夜。反应过夜后将连接产物转化大肠杆菌感受态。五、氯化钙法制备和感受态将大肠杆菌或感受态划线培养后,挑取单胞菌落于的培养液中,于振荡培养过夜。取转入的培养液中,于振荡培养左右至值为左右。将菌液转入离心管,冰上放置。的氯化钙悬浮,冰浴。,离心,细胞用预冷的浙江理工大学硕士学位论文的氯化钙,置于冰上待用。,离心,细胞悬浮于分别向每管管中加入感受态细胞,保存。以上均在无菌条件下操作完成。六、的转化取一支制备好的感受态,于冰上融化,将适量的质粒或连接产物加入感受态细胞中,冰上放置。水浴热激后,再置于冰上。培养液,振荡复活。加入/离心,保留少量上清,重新悬浮沉淀细胞。取少量细胞悬液均匀涂布在含有/的的平板上,。培养过夜。中间载体构建一、启动子的克隆本课题中用到的启动子序列以一质粒为模板通过方法获得,反应体系如下上游引物山下游引物山模板酶反应程序。预变性,。变性,退火,。延伸,个循环,。终延伸。反应结束通过琼脂糖凝胶电泳回收左右大小的目的片段。二、启动子片段与酶切后的片段连接浙江理工大学硕士学位论文和启动子回收产物和小抽产物均用进行双酶切,反应体系如下回收产物山山对如上回收片段进行连接,反应体系如下产物产物“,反应以上,将连接产物转化至感受态细胞中。后,选取适当大小的可疑茵斑,接种于含有/的的培养液中,震荡培养,小量质粒碱法提取,酶切鉴定出正确的质粒。穿梭载体的构建和进行将中间载体刎和质粒依次用酶切,体系如下模板反应后,琼脂糖电泳并回收目的片段片段和片段。将两个回收的片段进行连接反应,反应体系见下片段山浙江理工大学硕士学位论文山将上述反应体系连接后,将连接产物转化感受态细胞。挑取阳性菌落,小量提取质粒,酶切鉴定连接正确的穿梭质粒。穿梭载体的构建一、表达框的克隆以为模板,用表达框引物进行得出目的片段,体系如下表达框上游引物表达框下游引物山模板酶山延伸反应程序。预变性,。变性,退火,个循环,。延伸。反应结束后电泳回收左右大小的目的片段几表达框。将上述产物用进行酶切,体系如下几表达框产物山进行酶切,体系见下用浙江理工大学硕士学位论文山山因为和为同尾酶,故可将如上两种酶切产物进行连接,反应体系如下表达框酶切产物肛酶切产物连接后转化,涂板培养,挑取单克隆扩增后进行小量抽提质粒,具体方法参考上文。进行酶切鉴定。细菌内重组及鉴定一、骨架质粒转化入感受态中取一支制备好的感受态,于冰上融化,将适量的加入感受态细胞中,冰上放置。水浴热激后,再置于冰上。培养液,振荡复活。加入/离心,保留少量上清,重新悬浮沉淀细胞,取少量均匀涂布在含有/的的平板上,培养过夜。二、感受态的制备挑取单克隆鉴定正确后,将已转化入质粒的菌株做成感受态。方法同上的转化三、穿梭载体和首先需将穿梭载体柳和用酶进行线性化,酶切体系如下穿梭载体质粒浙江理工大学硕士学位论文山“。酶切后,直接将线性化的酶切产物取适量转化入感受态中,进行细菌内重组。转化方法见上文。后,选取适当大小的可疑菌斑,接种于含有/的的培养液中,震荡培养,小量质粒碱法提取,用酶切鉴定出重组成功的两种穿梭质粒菌株。酶切体系如下重组质粒山因在中的质粒是不稳定的,所以将鉴定正确的重组成功的穿梭质粒再次转化感受态细胞,再次用酶切鉴定正确的重组质粒,酶切体系同上。保存质粒和菌株,以便用于后续实验。重组腺病毒的小量扩增及鉴定病毒的小量制备将生长状态良好的细胞接种到中,十字交叉摇匀,置于,培养箱培养。当细胞达时,吸掉部分培养液,留少许覆盖细胞用移液枪将保存的空斑病毒原液加入中,混匀,放入,培养箱中后补加的培养液,放入培养箱继续培养约天后,待培养的细胞变圆,脱壁,部分细胞悬浮脱壁,则表明细胞已病变,用移液枪吹匀收集,放于保存备用。病毒的提取生长在孔板上的细胞感染病毒,待细胞病变后,收集细胞上清,的说明书进行病毒的提取按照试剂盒浙江理工大学硕士学位论文向病毒上清样品中加入蛋白酶,充分混匀后,加入,振荡,水浴温育加入无水乙醇,振荡,将液体转移到离心柱中,离心洗涤离心柱两次换接收管,分别用、,离心,接收管中即含病毒,即可进在离心柱中加入山行鉴定。重组腺病毒的鉴定我们使用两对引物分别进行鉴定重组腺病毒是否包装成功利用启动子上下游引物鉴定重组病毒是否含有启动子序列,利用几表达框上下游引物鉴定重组病毒是否含有几目的基因,利用野生型腺病毒的引物鉴定小扩后的病毒中是否含有野毒。反应体系如下的反应体系为病毒模板上游引物下游引物酶野毒鉴定反应程序预变性,变性,。退火,。延伸,个循环,终延伸。表达框目的基因鉴定的反应程序,退火温度为,其余均一致。取上述产物各,小孔胶进行琼脂糖凝胶电泳后,观察实验结果。病毒的大量扩增与纯化重组腺病毒的大量扩增用规格的大量扩增生长状态良好的细胞约盘,待细浙江理工大学硕士学位论文胞长至左右,吸去部分培养液,留少量覆盖细胞用移液枪将的病毒液加入中,培养箱培养后补加约培养液约天后,待培养的细胞变圆,部分细胞开始脱壁悬浮,且培养液颜色变黄色时即表明细胞已病变。这时向每个中加入约裂解细胞,待细胞裂解充分裂解,用移液枪收集病毒悬浮液,放入。保存备用。梯度离心法纯化重组腺病毒待收集的病毒细胞裂解液融化后,弃细胞碎片,收离心集上清。按照每病毒液上清加,分装至离心管,冰上放置,使沉淀病毒。密度为离心上述混合物,弃上清,将沉淀物悬浮在。/的溶液中溶剂为,离心,去除残留的杂蛋白,收集病毒悬浮液。梯度的制备在超速离心管中先加入溶液,再的/加入/的溶液,最后加入的/的与病毒混合液。注意加入时移液管贴壁轻轻上拉,不能产生气泡。,离心。处理的透收集密度在/之间的病毒条带至煮沸析袋中。透析过夜,中间需更换透析液一次。收集病毒,的管分装,于保存备用。一般按照如下表配制实验所需的各密度梯度的溶液表梯度离心所需溶液配制密度/浓度/量终体积溶于灭已过菌的,室温保存,每次使用前要重新测定密度。浙江理工大学硕士学位论文病毒滴度的测定本实验采用腺病毒滴度的常用检测方法法一半数组织培养感染量法对病毒的滴度进行测定。供试样品在不同稀释度下于细胞中形成细胞病变斑,通过形成的稀释度以及细胞病变的孔数来测定样品的感染性滴度。该方法不需对每个进行逐一计数,准确性和重复性较好,已成为腺病毒滴度测定的常规方法。实验方法如下细胞铺板取用砸胎牛血清培养的细胞个直径的,待细胞生长至,收集细胞并用胰酶消化计数。用的制备细胞悬液,每板需要大约浓度为/的细胞悬液。按每孔“即约个细胞加入一块孔板中如果加做一组重复试验,另加一块孔板。制备感染样品超净台内在无菌操作下进行腺病毒样品稀释将纯化后的病毒用无血清的分别稀释成、一、母、。、。、。和。等几个不同的梯度。感染病毒样品将孔板外围一圈各孔作为阴性对照,然后将稀释好的病毒样品按每排一个浓度依次感染孔板埘排,每个浓度梯度重复个复孔,每孔内加“标记为个连续梯度稀释的样品溶液,轻轻拍打板以混匀病毒样品,盖好孔板并在,培养箱内培养培养约天左右,观察并记录各浓度梯度病变孔的数目。结果计算结果观察,应同时满足下述条件,实验方为有效至少有一个样品稀释度的个孔中的每个孔都出现明显的细胞病变。至少有一个样品稀释度的个孔中最少有个但不多于个孔出现明显的细胞病变。至少有一个样品稀释度的个孔中无任何明显的细胞病变。病毒滴度计算公式对于样品,滴度。外浙江理工大学硕士学位论文稀释度对于倍的稀释度而言阳性比率之和从第一个倍稀释度算起按照以下公式,将/转换为/两次重复试验所得到的滴度差值应该。检测及蛋白水平的表达蛋白样品的获取将的结肠癌细胞铺于孔板,待细胞贴壁后,每孔加入的以及对照病毒和感染细胞,以不加病毒的细胞做对照,后,往细胞培养板中内加入裂解液其中加入至终浓度为/,冰上放置一,用细胞刮刮下贴壁的细胞,收集刮下的细胞及裂解液到管,离心,收集上清,分装后进行蛋白定量。于保存备用。蛋白的定量及其预处理蛋白定量试剂盒比色法取一块干净的孔板,将的蛋白标准品或蛋白样品加入孔中,设置个复孔。工作试剂加入孔中,轻微震荡混匀约,覆盖住该孔板或将者置于细胞培养箱内。于条件下,温育。在酶标仪上检测的大小。根据数值制作标准曲线,依据绘制的标准曲线计算出蛋白样品的浓度。预处理电泳前,计算好上样量以及上样体积,如/孔,。向样品中加入,并于水浴锅或干式恒温加热器热,煮沸。混合均匀后,分装至管中,保存。电泳实验开始前,首先根据待检测抗体对应的原始抗原的分子量大小,计算出胶浙江理工大学硕士学位论文的浓度,并算出分离胶各组分的用量。装好架子,按照下面配方配制或者其他比例的分离胶。在胶上面加入一层无水乙醇或者去离子水,以促进分离胶的凝集。待分离胶凝集后,配制的浓缩胶,插入预先准备好的梳子,同时注意避免产生气泡。待胶凝集后,加入待测样品,注意避免样品溢出。电泳时,浓缩胶使用电压,以防止蛋白浓缩效果不好。当样品跑至分离胶时,换用电压。一般电泳时间为左右。转膜转膜的好坏是影响实验结果的关键。常见的转膜方法有半干转法和湿转。常见的膜有膜及膜等,我们主要通过半干转进行转膜。实验操作如下首先将凝胶玻璃板置于盛有电泳转移缓冲液的平皿中,浸泡一会根据胶的大小进行裁剪滤纸和膜或膜,注意切滤纸和膜时一定要戴上手套,防止手上的蛋白会污染滤纸或膜,将裁剪好的滤纸和膜浸泡在电泳转移缓冲液中,驱除留在膜上的气泡。打开转移盒并放置浅盘中