整合素和粘着斑激酶在jwa基因抑制诱导的人肺动脉平滑肌细胞迁移调控中的作用

整合素和粘着斑激酶在JWA基因抑制诱导的人肺动脉平滑肌细胞迁移调控中的作用第3,1卷第期第L3贝2005年10月华中科技大学学报医学版MAMED1NIVSCILECHNOLHUAZHONGVO134NO5I513N2005博士后制度实施二十周年纪念专栏整合素和粘着斑激酶在JWA基因抑制诱导的人肺动脉平滑肌细胞迁移调控中的作用陆俊羽张珍祥徐永健邹晖倪望陈士新华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸内科武汉430030摘要目的探讨整合素和荇斑激酶是否在JWA基因抑制诱导的人肺动脉平滑肌细胞PASMCS迁移调控中起作用方法前期实验将JW,核鸸基因构建到逆转录病毒载体PLXSN上,转染人体外培养的人PASMCS内,并证实转染的JWA特异性核酶基凶能抑制PASMCS内JWA基因的表达该研究应用改良BOYDEN小室法测定细胞迁移情况半定RTICRSQRTICR法测定细胞内整合素AV,整合素B粘着斑激酶的MRNA表达量WESTERNBLOT法检测细胞内整合素M,整合素B,粘着斑激酶的蛋白表达量结果与空载体转染细胞PPLXSN组及未转染细胞PASMCS组比较转染JWA核酶基因的细胞PJWARZ组迁移率显着增加,细胞内整合素,整合素B粘着斑激酶的MRNA及蛋白表达量均显着增加结论整合素,粘着斑激酶信号通路可能在JWA基因抑制诱导的人肺动脉平滑肌细胞迁移中起调控作用关键词肌,平滑整合素粘着斑激酶中图法分类号R3227ROLEOFINTEGRINANDFOCALADHESIONKINASEINTHEREGULATIONOFHUMANPULMONARYARTERYSMOOTHMUSCLECELLSMIGRATIONINDUCEDBYINHIBITIONOFJWAGENEINVITROIUJUNYU,ZHANGZHENXIANG,XUYONGJIANETALDEPARTMENTOJRESPIRATORYDISEASESTONGJIHOSPITAL,TONGJIMEDICALCOLLEGE,HUAZHONGUNIVERSITY0/SIEMEANDTEHNOLOGY,WUHAN430030ABSTRACTOBJECTIVETOINVESTIGATETHEROLEOFINTEGRINANDFOCALADHESIONKINASEFAKINTHEREGULATIONOFHUMANPULMONARYARTERYSMOOTHMUSCLECELLSMIGRATIONINDUCEDBYINHIBITIONOFJWAGENE1“7LVITROMETHODSJWARIBOZYMEGENEWASSUBCLONEDINTOTHERETROVIRALVECTORPLXSNANDTHERECOMBINANTRETROVIRA1VECTORWASTRANSFECTEDINTOTHECULTUREDPASMCSTHETRANSFECTEDJWASPECIFICRIBOZYMEWASCONFIRMEDTOINHIBITTHEEXPRESSIONOFJWAGENEINTHEPASMCSCELLMIGRATIONWASMEASUREDBYUSINGMODIFIEDBOYDENCHAMBERTHEMRNAEXPRESSIONOFINTEGRINA,INTEGRIN8ANDFAKINCELLSWASDETECTEDBYSEMIQUANTITATIVERTPCRANDTHEPROTEINEXPRESSIONOFINTEGRINA,INTEGRINB3ANDFAKBYWESTERNBLOTRESULTSINCONTRASTTONORMALPASMCSGROUPANDPASMCSTRANSFECTEDONLYWITHPIXSNVECTORPPLXSNGROUP,THENUMBEROFMIGRATINGCELLSINTHECELLSTRANSFECTEDWITHJWARIBOZYMEGENEPJWARZGROUPWASINCREASEDSIGNIFICANTLYMEANWHILETHEMRNAANDPROTEINEXPRESSIONOFINTEGRINA,INTEGRIN良ANDFAKINTHESECELLSWASALSOINCREASEDSIGNIFICANTLYCONCLUSIONINTEGRINANDFAKSIGNALPATHWAYMAYPLAYAROLEINMIGRATIONREGULATIONOFHUMANPASMCSINDUCEDBYINHIBITIONOFJWAGENEEXPRESSIONILLVITROKEYWORDSMUSCLE,SMOOTHINTEGRINFOCALADHESIONKINASE肺动脉平滑肌细胞PASMCS由收缩型向合成型转化,并从中膜迁移至内膜是缺氧PASMCS增殖的前提条件已知血管平滑肌细胞VSMCS迁移与肌动蛋白细胞骨架的结构变化有关,且整个过程受着细胞内多种生长因子,生物活性物质及多国家自然科学基金资助项目NO30300L19【L国博士后科学基金资助项目NO2005037677陆俊羽女1972年生博士后条信号转导通路的精密调控,整合素INTEGRIN,粘着斑激酶FOCALADHESIONKINASE,FAK是其中重要的信号转导分子我们在前期实验中,通过将JWA核酶基因逆转录病毒载体转染人体外培养的人PASMCS内,证实该JWA核酶基因能有效抑制JWA基因的表达,可使PASMCS分化为合成表型,并促进细胞迁移本研究将探讨整合素A,整合素P和FAK是否在JWA基因抑制诱导的人514华中科技大学学报医学版2005年10月第3,1卷第5期肺动脉平滑肌细胞迁移中起调控作用1材料和方法11实验分组及材料我们在前期实验中,构建了JWA核酶基因逆转录病毒载体,转染人体外培养的人PASMCS内命名为PJWARZ组,同时转染PIXSN空载体人人PASMCS内命名为PPIXSN组,PPIXSN组和正常人PASMCS细胞PASMCS组作为对照组转染表达的JWA特异性核酶经证实能有效抑制人PASMCS内JWA的表达RNA提取试剂TRIZOL购自INVITROGEN公可,MMIV逆转录酶购自PROMEGA公司,改良BOYDEN小室购自江苏海门麒麟医用仪器厂小鼠抗人FAK单克隆抗体购自美国SANTACRUZ公司,兔抗人INTEGRIN0【V抗体,兔抗人INTEGRIN抗体购自武汉博士德生物公司,辣根酶标记山羊抗小鼠IGG二抗,辣根酶标记山羊抗兔IGG二抗购自北京中杉金桥生物公司SUPERSIGNALWESTPICO化学发光检测底物,蛋白酶抑制剂PROTEASEINHIBITORCOCKTAIL,PIC购自美国PIERCE公司12细胞迁移的测定用改良BOYDEN小室法上下小室间为硝酸纤维素滤膜8M孔径,下室为平滑肌细胞生长培养基,上室加入DHANK液制成的细胞悬液610/M1在细胞培养箱内5CO,37C静置培养6H,取出滤膜,用棉签将滤膜上室面的细胞擦去,置95乙醇中固定10MIN,苏木精染色510MIN,在光镜下计数迁移到滤膜下室面的平滑肌细胞数每组5张膜,每张膜随机计数5个高倍镜视野的细胞数13SQRTPCR法检测细胞内INTEGRIN及FAKMRNA表达用TRIZOL提取对数生长期的单层培养细胞的总RNA,RTPCR检测细胞内INTEGRIN【V,INTEGRIN及FAKMRNA表达,以PIACTIN为内参照根据人LACTIN基因序列BCO13835,人INTEGRIN叭基因序列NM002210,人INTEGRING基因序列NM000212,人FAK基因序列IL36L6,用PRIMER50软件设计引物序列GACTIN引物上游5R_CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC一3下游5一AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC一3扩增产物为587BPINTEGRIN0【V基因引物上游5一GATGGACCAATGAACTGCACT一3,下游5一ACAGCCAGTAGCAACAATCCT一3,扩增产物为491BPINTEGRING3基因引物上游5ACTGCCGTGACGAGATTGAGF一3,下游5TCGTGGATGGTGATGAGGAGT一3,扩增产物为268BPFAK基因引物上游5一CTTGACATACAA0GA一3,下游5一TCACCCAGGTCAGA1VRCA_3,扩增产物为3LLBPPCR采用94C预变性3MIN94变性40S,56C退火50S,72C延伸90S,35个循环7OC10MINPCR产物电泳,紫外灯下观察并照相照片扫描后,测定各条带积分吸光度值以灰度表示以同一管中IHTEGRIN或FAK和GACTIN产物条带积分吸光度值之比A/A作数据分析,以此反映INTEGRIN或FAKMRNA的表达程度14WESTERNBLOT法检测细胞内INTEGRIN及FAK蛋白表达收集各组细胞用19HANK液洗涤3次后,将细胞重悬于细胞裂解液1NP40,15OMMOL/INAC1,2OMMOL/IMPS,1去氧胆酸钠,1MMOL/IEDTA,1SDS,10“1/ML蛋白酶抑制剂中,冰浴10RAIN,使细胞充分裂解,12000R/MIN,4离心2OMIN,收集上清,用改良IOWRY法进行蛋白定量取10G蛋白,加入上样缓冲液,100C变性3MIN后进行SDSPAGE分离,电印迹至硝酸纤维素NC膜上进行封闭,用11000的一抗进行杂交,再与12000辣根过氧化物酶标记的IGG二抗共同孵育,最后用增强的化学发光试剂显色,X胶片曝光X胶片扫描后,用英国UVP公司GDS8000型凝胶成像分析系统测定各条带积分吸光度A值,以此反映INTEGRIN或FAK蛋白的表达程度15统计学分析应用SPSS120软件进行数据处理所有数据均采用表示组问差异用方差分析和,检验进行比较2结果21细胞迁移变化经计数,PASMCS组与PPIXSN组之间迁移细胞数无显着差异P0,05,而与PASMCS组和PPIXSN组相比较,PJWARZ组迁移细胞数显着增加PO01,见表122细胞内INTEGRIN和FAKMRNA的表达变化RTPCR产物电泳,结果见图L3PCR产物条带积分吸光度值之比A1/A,A“/AP和AFAK/A,PASMCS组与PPIXSN组之间差异均无显着性意义均P005,而PJWARZ组较PASMCS组与PPIXSN传牛薯表脯IWA酶柠ILLJT动脉FI|ILII啦赶髂鞘拌,I2,M12MRVIZRIPIWARZ组】,XSN蛆LIPASMS组图LRIFLH啪IIRJ】NJ,LI段,一T琼脂碰歧L的L邑淋鞋MMLRPASM【,组21P【,HN姐PJWARZ组图2LJ埔均LN“GRNL_旌殿侄琼脂糖凝脏上的电泳精RKRI1AM【,蛆2PXSX组P一WARZ蛆图3F【H增的FAK旧片段1琼脂精凝胶J的电浊结果麦LJWA幅酶基圈转睾对IAM迁社的响F,J,一】表2JWA燕酶基田转安对P,SM阿HMGRIT,和FAKN1RNA表运趵影响,HA23细胞内INTEGRLN爱FAK蛋白表选变化,GRIN搜【AK一的WT丧经图像分析屁示】ASM1PPIXSN组问_F11EGRI_D,ITLTUGRIN及FAK蜇RI均积分LL技光度俯莘均九并1意义均,N,5PJWARZ组LD1TGRIF1【N,I_】ICZRIN眨FK蛋平均积舒啦光慢眦UL如FP/XSMI口【XSN组均【I0I丧丧0JWA梭酶基匿转鞋LJIPASM,S内INTEGRIN和B“AK蛋自表达的嚣响PASMCS大量增5直是肺血管结构重建的主要囚索之一JJ前研究已III实,PASM【S收缩型向台成型转化,诈从巾帻迁移至内膜是低氧PASMS增殖的前提条件此探讨PASMCS迁移渊控机制是研究低氧性忡动脉高压,慢月源性心脏病技其他N管疾病发L制的重要方向F【1】制PASMT7S迁移比抑制PASM增殖或I秀导问亡巫早一个环可成为治疗低氧性肺动脉高的重要思路研究证实管平滑肌细胞迁移与肌动蛋白细胞骨架的结构变化有关L1肌动蛋白细胞骨架I肌功蛋白丝F1IN和特抖性的叭动蛋白结合蛋白成FATTIN调过牯巷斑FOCALADHESIONFA垫台素与细胞外基质CECM连接VSMCS的迁移过程小FA形成,肌功置白细胞骨架绢装以受档台索在FA处的族集均具有高度动态性,悭个细胞迁移的过程受着细胞内多种生因子生物活性物质受多条信号转通路的精密嗣掩较艇杂其FL整台素,FAK缩号通蹄起着重荽作用整台一516华中科技大学学报医学版2005年1O月第34卷第5期素不仅作为结构蛋白起黏附,锚定细胞并提供细胞运动牵引力的作用,而且在细胞迁移的信号转导过程中起关键作用VSMCS主要表达,整合素以及各种A整合素亚基口研究证明,由G蛋白偶联受体,整合素,生长因子受体介导的信号转导在FAK处发生“汇聚“,因此,FAK作为调节细胞基质黏附,细胞运动和细胞形态的信号转导通路的“枢纽点“,在VSMCS迁移的信号转导中具有举足轻重的作用JWA基因是从培养的原代人气管,支气管上皮细胞中分离到的受维甲酸RA诱导的细胞骨架样基因,该基因EDNA全长21KB,开放阅读框序列RF位于近5端,共564个核苷酸,编码含188个氨基酸的蛋白质,分子量为215KDL61KD一09921KU研究提示,在JWA基因的启动子序列中有完整的佛波酯TPA反应元件TRE,JWA蛋白可能是蛋白激酶CPROTEINKINASEC,PKC的作用底物_L,在细胞增殖,分化,细胞内通讯,细胞骨架的改变和核运输等方面起重要作用最近研究发现JWA蛋白是一种新的微管相关蛋白,与微管蛋白分布基本平行,在绝大多数情况下伴随微管动力学改变聚合或解聚而同步发生变化,并且可能参与了细胞有丝分裂的过程L“我们前期实验通过构建JWA核酶基因逆转录病毒载体转染人体外培养的人PASMCS内,证实该JWA核酶基因能有效抑制J