【2017年整理】生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程(1)

生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程本规程适用于人用生物制品生产/检定用动物细胞基质，包括具有细胞库体系的细胞及原代细胞。细胞基质系指可用于生物制品生产/检定的所有动物或人源的连续传代细胞系、二倍体细胞株及原代细胞。生产非重组制品所用的细胞基质，系指来源于未经修饰的用于制备其主细胞库的细胞系/株和原代细胞。生产重组制品的细胞基质，系指含所需序列的、从单个前体细胞克隆的转染细胞。生产的细胞基质，系指通过亲本骨髓瘤细胞系与另一亲本细胞融合的杂交瘤细胞系。一、对生产用细胞库细胞基质总的要求用于生物制品生产的细胞系/株均须通过全面检定，须具有如下相应资料，并经国务院药品监督管理部门批准。（一）细胞系/株历史资料的要求1细胞系/株来源资料应具有细胞系/株来源的相关资料，如细胞系/株制备机构的名称，细胞系/株来源的种属、年龄、性别和健康状况的资料。这些资料最好从细胞来源实验室获得，也可引用正式发表文献。人源细胞系/株须具有细胞系/株的组织或器官来源、种族及地域来源、年龄、性别及生理状况的相关资料。动物来源的细胞系/株须具有动物种属、种系、饲养条件、组织或器官来源、地域来源、年龄、性别、病原体检测结果及供体的一般生理状况的相关资料。如采用已建株的细胞系/株，应从具有一定资质的细胞保藏中心获取细胞，且应提供该细胞在保藏中心的详细传代过程，包括培养过程中所使用的原材料的相关信息，具有细胞来源的证明资料。2细胞系/株培养历史的资料应具有细胞分离方法、细胞体外培养过程及建立细胞系/株过程的相关资料，包括所使用的物理、化学或生物学手段，是否有外源添加序列，以及细胞生长特征、生长液成分、选择细胞所进行的任何遗传操作或选择方法等。同时还应具有细胞鉴别、检定、内源及外源因子检查结果的相关资料。应提供细胞培养液的详细成分，如使用人或动物源成分，如血清、胰蛋白酶、水解蛋白或其他生物学活性的物质，应具有这些成分的来源、制备方法及质量控制、检测结果和质量保证的相关资料。（二）细胞库的建立细胞库的建立可为生物制品的生产提供已标定好的、细胞质量相同的、能持续稳定传代的细胞种子。1原材料的选择建立细胞库的各种类型细胞的供体均应符合本规程细胞的检定中相关规定。神经系统来源的细胞不得用于生物制品生产。细胞培养液中不得使用人血清，如需使用人血白蛋白，则须使用有批准文号的合格制品。消化细胞用胰蛋白酶应进行检测，证明其无细菌、真菌、支原体或病毒污染。特别应检测胰蛋白酶来源的动物可能携带的病毒，如细小病毒等。用于生物制品生产的培养物中不得使用青霉素或内酰胺LACTAM类抗生素。配制各种溶液的化学药品应符合中国药典（二部）或其他相关国家标准的要求。2细胞操作的环境要求细胞培养的操作应符合中国药品生产质量管理规范的要求。生产人员应定期检查身体。在生产区内不得进行非生产制品用细胞或微生物的操作；在同一工作日进行细胞操作前，不得操作或接触有感染性的微生物或动物。3建立细胞库细胞库为三级管理，即原始细胞库、主细胞库及工作细胞库。如为引进的细胞，可采用主细胞库和工作细胞库组成的二级细胞库管理。在某些特殊情况下，也可使用MCB一级库，但须得到国务院药品监督管理部门的批准。（1）原始细胞库PCB由一个原始细胞群体发展成传代稳定的细胞群体，或经过克隆培养而形成的均一细胞群体，通过检定证明适用于生物制品生产或检定。在特定条件下，将一定数量、成分均一的细胞悬液，定量均匀分装于安瓿，于液氮或130以下冻存，即为原始细胞库，供建立主细胞库用。（2）主细胞库MCB取原始细胞库细胞，通过一定方式进行传代、增殖后均匀混合成一批，定量分装，保存于液氮或130以下。这些细胞必须按其特定的质控要求进行全面检定，应合格。主细胞库用于工作细胞的制备，每个生产企业的主细胞库最多不得超过两个细胞代次。（3）工作细胞库WCB工作细胞库的细胞由MCB细胞传代扩增制成。由MCB的细胞经传代增殖，达到一定代次水平的细胞，合并后制成一批均质细胞悬液，定量分装于安瓿或适宜的细胞冻存管，保存于液氮或130以下备用，即为工作细胞库。每个生产企业的工作细胞库必须限定为一个细胞代次。冻存时细胞的传代水平须确保细胞复苏后传代增殖的细胞数量能满足生产一批或一个亚批制品。复苏后细胞的传代的水平应不超过批准的该细胞用于生产限制最高限定代次。所制备的WCB必须经检定合格（见本规程细胞检定中有关规定）后，方可用于生产。4细胞库的管理每种细胞库均应分别建立台帐，记录放置位置、容器编号、分装及冻存数量，取用记录等。细胞库中的每支细胞安瓿或细胞冻存管均应注明细胞系/株名、代次、批号、编号、冻存日期，储存容器的编号等。冻存前细胞活力应在90以上，复苏后细胞存活率应不低于85。冻存后的细胞，应至少作一次复苏培养并连续传代至衰老期，检查不同传代水平的细胞生长情况。主细胞库和工作细胞库分别存放。非生产用细胞应与生产用细胞严格分开存放。（三）细胞检定细胞检定主要包括以下几个方面细胞鉴别、外源因子和内源因子的检查、致瘤性检查等。必要时还须进行细胞染色体核型检查。这些检测内容对于MCB细胞和WCB细胞及生产限定代次细胞均适用。细胞检定的基本要求见下表1。细胞库建立后应至少对MCB细胞及生产终末细胞进行一次全面检定。每次从MCB建立一个新的WCB，均应按规定项目进行检定。表1、细胞检定项目要求生产终末细胞是指按生产规模制备的终末代次细胞。1细胞鉴别试验新建细胞系/株、细胞库MCB和WCB和生产终末细胞应进行鉴别试验，以确认为本细胞，无其他细胞的交叉污染。细胞鉴别试验方法有多种，包括细胞形态、生物化学法如同工酶试验、免疫学检测如HLA、种特异性抗血清、细胞遗传学检测如染色体核型、标记染色体检测、遗传标志检测如DNA指纹图谱、STR图谱、基因组二核苷重复序列等。可选其中一种或几种方法，但均须经国家药品检定机构认可。细胞表型特征与遗传学特征相结合来判断，更有利于细胞鉴别。2无菌检查取混合细胞培养上清液样品，依法检查，应符合要求（附录XIIA）。3支原体检查取细胞培养上清液样品，依法检查，应符合要求（附录XIIB进行），应为阴性。4细胞内、外源病毒因子检查应注意检查细胞系/株中是否有来源物种中潜在的可传染的病毒，以及由于检测项目MCBWCB生产终末细胞细胞鉴别无菌检查支原体检查病毒污染检查外源病毒体外培养法体内接种法种属特异性病毒逆转录病毒细胞致瘤性操作带入的外源性病毒。细胞进行病毒检查的种类及方法，须根据细胞的种属来源、组织来源及细胞特性决定。（1）细胞形态观察及血吸附试验取混合瓶细胞样品，接种至少6个细胞培养瓶或培养皿，待细胞长成单层后换维持液，持续培养两周。如有必要,可以适当换液。每日镜检细胞，细胞应保持正常形态特征。如为贴壁细胞或半贴壁细胞，细胞至少培养14天后，分别取1/3细胞培养瓶或培养皿，用0205豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液进行血吸附试验。加入红细胞后置2830分钟，然后置202530分钟，分别进行镜检，观察红细胞吸附情况，结果应红细胞吸附应为阴性。新鲜红细胞在28保存不得超过7天,且溶液中不应含有钙或镁离子。（2）不同细胞传代培养法检测病毒因子将待检细胞分别接种下列三种单层细胞，包括猴源细胞、人源二倍体细胞和同种属同组织类型来源的细胞。每种单层细胞接种至少107个含有原细胞培养上清液的活细胞悬液或细胞裂解物，每种细胞至少接种2瓶。接种供试品量应占维持液的1/4以上，培养至少14天。试验应设立病毒阳性对照，包括可观察细胞病变的病毒阳性对照、血凝阳性对照及血吸附阳性对照。如细胞裂解物对单层细胞有干扰，则应排除干扰因素。在培养第7天时，分别取每种接种的单层细胞上清液各一瓶，分别接种于新鲜制备的相应的单层细胞上，继续培养7天，观察细胞病变并进行细胞形态观察及血吸附试验。每种接种的单层细胞不得出现细胞病变，血吸附试验应均为阴性。若待检细胞已知可支持人巨细胞病毒CMV的生长，则应在接种人二倍体细胞后至少观察28天，应无细胞病变。同时，应进行血吸附试验,应为阴性。（3）接种动物和鸡胚法检测病毒因子MCB或WCB细胞、增殖到或超过生产用体外细胞龄限制代次的细胞须采用动物体内接种法进行外源病毒因子检测。选用乳鼠、成鼠和鸡胚两组不同日龄共计4组，按表2所列方法进行试验和观察。接种细胞后，任何动物出现异常或疾病均应进行原因分析。观察到期时，应至少有80以上接种动物或鸡胚健存，视为试验有效。接种动物未显示有外源病毒感染，则细胞判定为合格。表2动物体内接种法检测外源病毒因子动物组要求数量接种途径细胞浓度个活细胞/ML接种细胞液量ML/只观察天数结果判定乳鼠24小时内102窝脑内腹腔1X1070010121应健存成鼠1520G10脑内腹腔1X1070030521应健存鸡胚911日龄10尿囊腔1X1070234尿液血凝试验阴性鸡胚56日龄10卵黄囊1X107055应存活豚鼠350500G5腹腔1X1075042应健存，解剖无结核病变家兔1525KG5皮下皮内1X1079001X1021无异常，健存经尿囊腔接种的鸡胚，在观察末期，应用豚鼠和鸡红细胞混合悬液进行直接红细胞凝集试验。每只家兔于皮内注射10处每处01ML对于新建细胞系/株，还应接种豚鼠和家兔（见表1）。豚鼠主要用于检查细胞内结核分支杆菌，在注射前观察4周，结核菌素试验为阴性者方可用于试验。家兔主要用于检测猴来源细胞中是否存在B病毒污染，也可用兔肾细胞培养法代替。（4）逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测可采用下列方法对MCB或WCB细胞、增殖到或超过生产用体外细胞龄限制代次的细胞进行逆转录病毒的检测。逆转录酶活性测定采用敏感的方法,如产品增强的逆转录酶活性测定法PERT法或其他灵敏度相当的检测逆转录酶的方法检测细胞培养液上清中逆转录酶活性。透射电镜检查收集待检细胞，低速离心后，弃上清，沉淀中应含有1107个细胞，且细胞存活率应不低于99。在沉淀中加入固定剂，于4保存或直接包埋后制备超薄切片，置于铜网上染色后透射电镜观察。感染性试验将待检细胞感染逆转录病毒敏感细胞，培养后检测。根据待检细胞的种属来源，须使用不同的敏感细胞进行感染性试验。这三种方法具有不同的检测特性及灵敏度，因此应采用不同的方法联合检测。若逆转录酶活性检测阳性时，建议进行透射电镜检查及感染性试验，以确证是否有感染性逆转录病毒颗粒存在。小鼠来源和其他啮齿类来源的细胞系或其杂交瘤细胞系有可能携带潜在的逆转录病毒。因此，对于人鼠杂交瘤细胞系则应进行特异性逆转录病毒检测。如用于单克隆抗体生产的小鼠细胞系，则可不检测特异性的逆转录病毒，但在生产工艺中应增加病毒灭活程序。（5）特殊外源病毒因子的检测应对MCB或WCB的细胞进行特殊病毒的检测。检测病毒的种类应根据细胞系/株种属、组织来源等确定。如鼠源的细胞系，可采用小鼠、大鼠和仓鼠抗体产生试验检测其种特异病毒。人源的细胞系/株，则应检测如人鼻咽癌病毒、人巨细胞病毒、人逆转录病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒。在某些情况下，也可能进行转化病毒的检测，如人乳头瘤病毒、腺病毒及人单纯疱疹病毒。这些病毒的检测可采用适当的体外检测技术。5致瘤性检查某些传代细胞系已证明具有致瘤性，如来源于啮齿类的细胞系BHK21，CHO，C127细胞等，或细胞类型属致瘤性细胞，如杂交瘤细胞，则可不必作致瘤性检查。某些传代细胞系已证明在一定代次内不具有致癌性，而超过某代次则具有致瘤性，如VERO细胞，则必须进行致瘤性检查。人上皮细胞系、人二倍体细胞株及所有用于活病毒疫苗生产的细胞系/株应进行致瘤性检查。另外，新建细胞系/株必须进行致瘤性检查。在某些情况下，用于人体细胞治疗及基因治疗的细胞也须进行致瘤性检查。将MCB或WCB的细胞增殖到或超过生产用体外细胞龄限制代次，再进行致瘤性试验。”下述两种致癌性试验方法可任选其一裸鼠至少10只，将细胞悬浮于适量无血清培养基中，使细胞浓度为5107个细胞/ML，每只裸鼠皮下或肌内注射02ML；同时用HELA或HEP2细胞设立阳性对照，阳性对照组至少10只，每只注射02ML含106个细胞；可用人二倍体细胞株作为阴性对照，阴性对照组至少10只，每只注射02ML含1067个细胞。新生小鼠35日龄，810G小鼠10只，在出生后第0天、2天、7天和第14天，分别用01ML抗胸腺血清ATS或球蛋白处理，然后同上每只皮下接种107活细胞。并设立阳性对照组，对照组至少接种10只。结果判定定期观察并触摸注射部位有无结节形成，且形成的任何结节均应进行双向测量并记录。阳性对照组应至少有9只有进行性肿瘤生长时，试验视为有效。如试验组动物有进行性生长的结节或可疑病灶，应观察至少12周；若出现的结节在观察期内开始消退，则应在结节完全消退前，处死动物并进行解剖作病理及组织学检查。未发生结节的动物半数应观察21天，剖检，另外半数动物应观察12周，进行病理检查，剖检接种部位，观察各淋巴结和各器官有无结节形成，如有怀疑，进行病理组织检查，不应有转移瘤形成。除上述体内法外，也可采用软琼脂克隆形成试验或器官培养试验等体外法检测，特别适用于在低代次时在动物体内无致瘤性的传代细胞系。（四）生产用细胞培养生产用原材料的选择和细胞操作环境应符合本规程细胞库的建立中有关规定。从冻存的WCB中取出一支或多支安瓿，混合后培养，传至一定代次后供生产用。其代次不得超过该细胞用于生产的最高限定代次。生产用细胞的最高限定代次应根据研究结果确定，但不得超过国际认可的最高限定代次。从WCB取出的细胞种子增殖的细胞不得再回冻保存后而再用于生产。体外培养细胞龄的计算二倍体细胞龄以细胞群体倍增（POPULATIONDOUBLING）计算，以每个培养容器细胞群体细胞数为基础，每增加一倍作为一世代，即一瓶细胞传二瓶12分种率，再长满瓶为一世代；一瓶传四瓶14为二世代；一瓶传八瓶18则为三世代。生产用细胞龄限制在细胞寿命期限的前2/3内。传代细胞系则以一定稀释倍数进行传代，每传一次为一代。二、连续传代细胞系的特殊要求传代细胞系一般是由人或动物肿瘤组织或正常组织传代或转化而来，可悬浮培养或采用载体培养，能大规模生产。这些细胞可无限传代，但到一定代次后，致瘤性会增强。所以对生产用传代细胞系应进行严格检查。应按本规程细胞的检定的规定进行细胞库的检查。对生产过程中细胞培养的要求如下1用于生产的细胞代次用于生产的传代细胞系，生产代次应有一定限制。用于生物制品生产的细胞最高限定代次，须经批准。2生产过程中细胞培养物检查对于病毒类制品，在生产末期，应按照本规程中的三6（2）、（3）、（4）和（5）对生产对照用细胞进行检查，并合格。对于在不同时间收集合并的培养物，应在每次收集时检测对照细胞培养物。三、人二倍体细胞株的特殊要求新建的人二倍体细胞必须具有以下资料建立细胞株所用胎儿的胎龄和性别、终止妊娠的原因、所用胎儿父母的年龄、职业及健康良好的证明（医师出具的健康状态良好、无潜在性传染病和遗传性疾患等证明），以及胎儿父系及母系三代应无明显遗传缺陷疾病历史的书面调查资料。人二倍体细胞株应在传代过程的早期，选择适当世代水平（28世代）增殖出大量细胞，定量分装后，置液氮中或130下冻存，供建立PCB之用，待全部检定合格后，即可正式定为PCB，供制备MCB用。1染色体检查及判定标准新建人二倍体细胞株及其细胞库必须进行染色体检查。对于已建株的人二倍体细胞株，如WI38、MRC5、2BS，KMB17等，在建立MCB时可不必进行细胞染色体检查。但如对细胞进行了遗传修饰，则须按新建细胞株进行染色体检查。（1）染色体检查新细胞建株过程中，每812世代应作一次染色体检查，一株细胞整个生命期内连续培养过程中，至少应有4次染色体检查结果。每次染色体检查，应至少随机取1000个分裂中期细胞，进行染色体数目、形态和结构检查，并作记录以备复查。其中至少选择50个分裂中期细胞进行显微照相，作出核型分析，并应粗数500个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率。每次染色体检查，应从同一世代的不同培养瓶中取细胞，混合后进行再培养，制备染色体标本片。染色体片应长期保存，以备复查。可用G分带或Q分带技术检查50个中期细胞染色体带型，应用照相图片作出带型分析。（2）判定标准对1000个和500个中期细胞标本异常率进行检查，合格的上限可信限90POISON法如表2。表2人二倍体细胞染色体分析标准检查细胞数异常1000500100染色单体和染色体断裂47268结构异常17102超二倍体852亚二倍体1809018多倍体30174亚二倍体如超过上限，可能因制片过程人为地丢失染色体，应选同批号标本重新计数。一个中期细胞内超过53条染色体即为一个多倍体。2无菌检查每812世代细胞培养物，应进行无菌检查，依法检查，应符合规定（附录XIIA）。3支原体检查每812世代细胞培养物，应进行支原体检查，依法检查，应符合规定（附录XIIB）。4病毒检查二倍体细胞株传代过程中，至少对2个不同世代水平进行病毒包含体、乙型肝炎、丙型肝炎、EB病毒，艾滋病病毒进行检查等，结果应均为阴性。5致瘤性检查每812世代应作一次致瘤性检查，（方法见本规程致瘤性检查），结果应无致癌性。6生产过程细胞培养检查（1）染色体检查可根据制品特性及生产工艺，确定是否进行生产过程中细胞培养的染色体检查。通常含有活细胞的制品或下游纯化工艺不足的制品，应对所用细胞培养进行染色体检查及评价。（见本规程“染色体检查及判定标准”）但如采用已建株的人二倍体细胞生产，则不要求进行染色体核型检查。（2）细胞鉴别试验按本规程“细胞检定”中细胞鉴别试验进行。对于每个制品生产用细胞每年应至少进行一次该项检定。（3）无菌检查依法检查，应符合规定（附录XIIA）。（4）支原体检查依法检查，应符合规定（附录XIIB）。（5）正常细胞外源病毒因子检测制备病毒类制品时，于接种病毒的当天或在连续传代的最后一次接种病毒时，留取此批细胞的5或不少于500ML的细胞不接种病毒，换维持液作为正常细胞对照。与接种病毒的细胞在相同条件下培养，并按附录C生产用细胞外源因子检查项进行检测。四、重组细胞的特殊要求重组细胞系通过DNA重组技术获得的含有特定基因序列的细胞系，因此重组细胞系的建立应具有细胞基质构建方法的相关资料，如细胞融合、转染、筛选、集落分离、克隆、基因扩增及培养条件或培养液的适应性等方面的资料。细胞库细胞的检查应按本规程细胞的检定的规定进行，但还应进行下述检查1细胞基质的稳定性生产者须具有该细胞用于生产的目的基因的稳定性资料，包括重组细胞的遗传稳定性、目的基因表达稳定性、目的产品持续生产的稳定性，以及一定条件下保存时细胞生产目的产品能力的稳定性等资料。2鉴别试验除按本规程“细胞鉴别试验”进行外，还应通过检测目的蛋白基因或蛋白进行鉴别试验。3重组细胞产物的外源病毒因子检测应按本规程“细胞形态观察及红细胞吸附试验”和“不同细胞传代培养法检病毒因子”的要求对细胞裂解物或收获液及生产用培养基进行外源病毒因子的检测。五、原代细胞的要求原代细胞应来源于健康的动物脏器组织或胚胎，包括猴肾、地鼠肾、沙鼠肾、家兔肾、狗肾或动物的胎儿和其他组织以及鸡胚和鹌鹑胚等正常组织，以适当的消化液消化、分散组织细胞进行培养，原代细胞不能建立细胞库，只能限于原始培养的细胞或传代少数几代内（一般15代内）使用，无法事先标定。因此，只能严格规范管理和操作措施，以保证以原代细胞为基质所生产的制品质量。（一）动物组织来源和其他材料1动物组织来源应符合“凡例”的有关要求。对各种动物都应有明确健康状况和洁净级别要求。2生产或检定用猴多采用非洲绿猴、恒河猴等，我国以恒河猴为主。应为正常健康猴，以笼养或小群混养。动物用于制备细胞前，应有6周以上的检疫期，检疫期中出现病猴或混入新猴，应重新检疫。从外面新引入猴群应作结核菌素试验及猴疱疹I型病毒B病毒的检查。胎猴肾可用于生产，对其母猴应进行检疫。（二）原代细胞培养物的检查用于细胞制备的动物剖检应正常，取留的器官组织亦应正常，如有异常，不能用于制备细胞。1细胞培养原材料检查及细胞培养操作按本规程“原材料的选择”及“细胞培养操作的环境要求”进行。2细胞培养物的检查（1）细胞形态检查细胞在接种病毒或用于生产前，其培养物均应进行外观检查和镜检，应无任何可疑、异常和病变，否则不得用于生产。（2）对照细胞检查每批消化所得原代细胞留取5或至少500ML悬液，不接种病毒，细胞浓度和处理均与生产制品过程相同，至少观察14天，并作下列各项检查，结果均应为阴性。无菌检查依法检查，应符合规定（附录XIIA）。支原体检查依法检查，应符合规定（附录XIIB）。外源病毒污染的检查对观察到期的细胞，按本规程4（1）项“细胞形态观察及血吸附试验”和4（2）项“不同细胞传代培养法检测病毒因子”项进行外源病毒污染检测。原代细胞培养物特定病毒检查原代猴肾细胞培养应检查SV40病毒、猴艾滋病毒和B病毒。应用VERO或原代绿猴肾细胞、兔肾细胞检查。地鼠肾原代细胞应用BHK21细胞培养检查，观察细胞形态，如有可疑应在同种细胞上盲传一代继续观察。六、检定用细胞的要求检定用细胞是指生物制品制造过程中用于检定的细胞，包括原代细胞、连续传代细胞或二倍体细胞，以及经特定基因修饰过的细胞。检定用细胞的质量对检定结果的判定具有重要的影响，因此，为保证检定结果的有效性、可靠性及真实性，国家药品检定检定机构和生物制品生产企业检定部门所用的检定用细胞应符合下列要求（一）细胞资料1、检定用细胞应具有明确的合法来源，及相关的来源证明资料。2、如使用传代细胞系/株，应建立细胞库体系，即主细胞库及工作细胞库，如细胞使用量较少，可建立单一细胞库。各制品应根据其特性以及保证检测结果的可靠性基础上，在该细胞允许的最高限定代次内，规定相应检定用细胞的代次范围（应在确定细胞代次的1代范围内）。检定时从工作细胞库复苏细胞后，不能再回冻。3、应详细记录检定用细胞建库的过程，包括细胞培养所用原材料的来源、批号，细胞生长液的配制方法、使用浓度等，记录细胞的传代及冻存过程，并建立细胞冻存及使用台账。（二）细胞检定生物制品检定用细胞应至少进行以下13项检定，根据检定用细胞用途的不同，还应按照4项下的有关要求进行相关的检定。1、细胞鉴别试验按本规程一（三）1项进行，或其他相适应的方法，应确认为本细胞而无其他细胞的交叉污染。2、无菌检查依法检查，应符合要求（附录XIIA）。3、支原体检测依法检查，应符合要求（附录XIIB）。4外源病毒污染检查用于待检样品外源病毒污染检查所用的细胞，应采用本规程一（三）4（2）项及4（3）项鸡胚接种检查，应无外源病毒污染。5、其他检测（1）致瘤性检查对于待检样品致瘤性检查时所用的阳性对照细胞，应采用本规程一（三）5项进行检查，应具有致瘤性。（2）病毒敏感性检查用于活病毒类待检样品病毒效价测定的检定用细胞，应进行此项检查，证明所用细胞具有足够的相应病毒敏感性。（3）细胞功能检查用于待检样品生物学活性、效力或效价测定的检定用细胞，应进行此项检查，证明所用细胞能够有效评价待检样品质量。附录逆转录酶活性检查法附录IXM逆转录酶活性检查法本法系以雀麦草花叶病毒RNA为模板，采用RTPCR法扩增特定片段并用ELISA法检测特异片段与探针的杂交信号，从而测定供试品中的逆转录酶活性。试剂1供试品稀释液A液每1LA液含三羟甲基氨基甲烷盐酸（TRISHCL,PH75）25MMOL,氯化钾50MMOL,二硫苏糖醇DTT5MMOL,四甲基乙二胺（EDTA）025MMOL,TRITONX10025ML,甘油500ML。2供试品保存液液每1LA液中含1MG亮抑蛋白酶肽、07MG抑胃肽及1MG抑蛋白酶肽。3引物及探针序列上游引物5BIOTINCGTGGTTGACACGCAGACCTCTTAC3下游引物5TCAACACTGTACGGCACCCGCATTC3探针5NH2ATTATCTGGCCTTTGAGAGTTACTCTTTG34模板雀麦草花叶病毒RNABMVRNA5反转录缓冲液每1L反转录缓冲液含TRISHCLPH8350MMOL,氯化钾40MMOL,氯化镁6MMOL,DTT10MMOL，脱氧核糖核苷酸200MOL,下游引物08103MMOL。6扩增缓冲液每1L扩增缓冲液含TRISHCLPH8825MMOL,氯化钾40MMOL,氯化镁2MMOL,脱氧腺嘌呤核糖核苷酸200MOL、脱氧胞嘧啶核糖核苷酸200MOL、脱氧鸟嘌呤核糖核苷酸200MOL及脱氧尿嘧啶核糖核苷酸200MOL,上、下游引物各04103MMOL，核糖核酸酶A08G，TAQDNA聚合酶6104U，尿嘧啶N糖基化酶（UNG）4104U。（7）封闭液3牛血清白蛋白或05酪蛋白溶液。8变性缓冲液02MOL/L氢氧化钠，5MMOL/LEDAT。（9）包被液005MOL/L磷酸氢二钠溶液（PH85）供试品、阳性对照及灵敏度供试品的制备1取供试品200L，每分钟5000转离心5分钟，取上清液100L，加入B液100L和焦炭酸二乙醇（DEPC）处理的5TRITONX1002L，混匀后，置冰浴15分钟后，置70保存备用。2阳性对照用SP2/0细胞培养上清液作阳性对照，同上处理后，按单次使用量分装，70保存备用。3灵敏度供试品取鼠源白血病病毒逆转录酶（MMLV）用A液进行系列稀释至108U/L，充分混匀，按单次使用量分装，70保存备用。检查法（1）反转录将已处理的供试品及阳性对照用A液作10倍稀释。反转录反应管中加入反转录缓冲液208L，500MG/LBMVRNA02L，混匀后，标记，70放置10分钟，置冰浴。在相应的反转录反应管中分别加入4L已稀释的供试品、阳性对照及灵敏度供试品，以A液作阴性对照。反转录反应体系为25L。37反应90分钟。（2）PCR扩增取反转录产物5L加至PCR扩增缓冲液20L中，PCR扩增反应体系为25L。混匀后，按下列条件进行扩增3730分钟，预变性945分钟，9445秒，5645秒，7245秒，进行35个循环，72延伸5分钟。（3）杂交检测用经包被液适当稀释的探针100L包被DNA结合板，4过夜；次日，用封闭液37封闭60分钟,洗涤3次，备用；扩增结束后，每个反应管中加入变性液25L，混匀；在封闭洗涤后的包被板上每孔加入供试品25L，再加入杂交液100L，混匀后，37反应60分钟，用洗涤液洗涤5次；每孔中加入链亲合素标记的辣根过氧化物酶100L，37反应30分钟；同上洗涤5次；每孔加入显色液100L，37显色10分钟；每孔加入终止液100L终止反应。以630NM为参考波长，于波长492NM处测定吸光度。结果判定CUTOFF值为阴性对照的吸光度值加02。阴性对照吸光度值应不高于02，如小于005按005计。阳性对照应为阳性，且吸光度值应不低于15。灵敏度供试品应为阳性，且吸光度值应不低于08。供试品吸光度值大于CUTOFF值者为阳性。注意事项（1）如供试品为培养细胞，则将细胞传代后，培养34天长成单层，取上清检测，取供试品前不得换液。2试验中所有试剂及吸头均需灭菌。与RNA操作有关的试剂及材料均需经过DEPC处理。3加供试品区、扩增区及PCR产物检测区及其所用加样枪及服装应严格区分。4定期对各区进行消毒，PCR产物及其加供试品吸头应及时进行有效处理。第三章电气绝缘节设备安装第一节电气绝缘节ZPW2000A无绝缘轨道电路分电气绝缘节和机械绝缘节两种。在电气绝缘节处通过发送调谐单元、接收调谐单元、空芯线圈、钢轨电感及钢轨引接线电感组成串、并联谐振，对相邻区段的频率呈零阻抗端（电压很低相当于短路状态），起到隔离任用；而对于本区段的频率呈极阻抗端（电压很高），能够使接收设备可靠工作，保证信号传输的可靠性。一、电气绝缘节处设备电气绝缘节处设备布置示意图，如图31所示。二、设备的组成电气绝缘节处设备的组成是由调谐单元ZWT1（F1、F2）、空芯线圈（ZWXK1）、匹配变压器、防雷单元、钢轨引接线、设备连接线、防护盒、基础桩、小枕木以及小枕木、钢轨、轨枕卡具；设备的规格及数量见表31。表31电气绝缘节处设备表序号名称规格单位数量备注1调谐单元ZWT1台1F11700HZ、2000HZ2调谐单元ZWT1台1F22300HZ、2600HZ3空芯线圈ZWXK1台14匹配变压器ZPWBP台25设备防雷单元套16钢轨引接线2000MM根3钢包铜注油线7钢轨引接线3700MM根3钢包铜注油线8设备与设备连接线250MM根274MM2多股铜缆9设备与设备连接线500MM根274MM2多股铜缆10防护盒台3双体防护盒11小枕木块312设备基础桩根313小枕木卡具个614钢轨卡具个615轨枕卡具个6第二节设备安装一、设备定位1、信号点处设备定位根据设计文件依照有效施工图纸对所安装信号机的地点位置进行确定，然后以信号机机柱中心为基准，在所属线路用钢尺（30M）进行测量，从而确定出其它设备的位置，并用红油漆做好标记。之所以以信号机机柱中心为基准进行定位，是为了避免误差积累。设备位置定位具体尺寸如下（1）发送调谐单元防护盒中心距信号机机柱中心（列车运行方向）为1000MM，防护盒边缘跑所属线路中心不得小于2220MM。（2）接收调谐单元防护盒中心距信号机机柱中心（列车运行方向）为30M，防护盒边缘跑所属线路中心不得小于2220MM。（3）空芯线圈防护盒中心距信号机机柱中心（列车运行方向）为155M，防护盒边缘距所属线路中心不得小于2220MM。具体设备位置定位尺寸见图31所示。2、分割点处设备定位根据设计文件依照有效施工图纸对所安装空芯线圈防护盒的地点位置进行确定，然后以空芯线圈防护盒中心为基准，在所属线路用钢尺（30M）进行测量其它设备的位置，并用红油漆做好标记。设备位置定位尺寸如下（1）发送调谐单元防护盒中心距空芯线圈防护盒中心（列车运行方向）为145M，防护盒边缘距所属线路中心不得小于2220MM。（2）接收调谐单元防护盒中心距空芯线圈防护盒中心（列车运行反方向）为145M，设备防护盒边缘距所属线路中心不得小于2220M。具体设备位置定位尺寸如图31所示。二、基础安装1、根据设备基础桩体积大小，在距所属线路轨内侧1700MM处开挖一个长500MM、宽500MM、深900MM（坑底距轨面）的方坑。2、基础坑挖好后，用钢卷尺测量，将钢卷尺（用直尺更好）一端放置坑底，另一諯垂直于坑底向上拉出钢卷尺，而另一人到所属线路外侧以两根钢轨上平面为基准，核查验正基础坑是否符合安装标准，测量合格将基础桩放置于坑内，埋设深度不小于地面下500MM；基础桩上的引线孔面向大地。3、基础桩上平面边缘（靠所属线路侧）跑所属线路中心不得小于2220MM（并保证安装上防护盒后，防护盒内侧距所线路中心不得小于2220MM）。用钢卷尺在基础桩上平面边缘两端距所属线路内侧测量其方正。基础桩结构如图32（A）、基础桩埋设示意图32（B）所示。图32（A）基础桩示意图图32（B）基础桩布置示意图三、调谐单元、匹配变压器的安装1、调谐单元、匹醉心为压器设备示意图如图33（A）所示、如图33（B）所示。2、调谐单元应面向所属线路侧立式安装。3、匹配变压器应面向大地侧立式安装。4、调谐单元与匹配变压器应是背靠背，用两套配套螺栓（M10）将调谐单元、匹配变压器安装固定在同一基础桩的固定板上，并用转矩扳手将其紧固。如图33（C）所示。图33（A）调谐单元设备示意图图33（B）匹配变压器设备示意图图33（C）设备布置示意图四、空芯线圈的安装1、空芯线圈设备示意图如图34（A）所示。2、空芯线圈应面向所属线路侧立式安装，在安装时注意电气绝缘节处用ZWXK1型号空芯线圈了，而在机械绝缘节处（站口）用ZWXKJ型号空芯线圈。3、用两套配套螺栓（M10）将空芯线圈安装固定在基础桩的固定板上，并用转矩扳手将其紧固。空芯线圈安装如图34（B）所示。图34（A）空芯线圈设备示意图图34（B）空芯线圈布置示意图五、调谐单元（及匹配变压器）、空芯线圈防护盒的安装1、防护盒安装在调谐单元（匹配变压器）或空芯线圈外，与基础面固定在一起；2、用钢卷尺和水平尺测量将水平尺放在防护盒上面，在水平面的两上方向进行水平调整，观查水平尺内气泡流动到中间为宜。用钢卷测量防护盒内侧边缘两端距最近钢轨轨内侧为1500MM；顶面距轨顶面为200MM。注意测量防护盒内侧边缘跑所属线路中心安装尺寸时，应在防护盒顶面距轨顶面200MM的位置处进行测量；防护盒安装如图35所示。图35防护盒安装示意图第三节引接线与设备的连接及安装一、74MM2铜芯连接线的制作及安装1、工具及材料见表32表3274MM2铜芯连接线的制作工具及材料2、74MM2铜芯连接线的制作。（1）用钢锯截取250MM及500MM的铜缆各两根。（2）用电工刀将截取的铜缆两端外皮剥开并除去6MM长，使其露出里面铜线。（3）将剥好的铜线穿入冷压铜端头（10MM2/6MM）内，并使铜缆外皮截面紧贴铜端头防护管。（4）压接冷面铜端头有两种方法1）用机械压接钳进行压接，找到合适钳口，将穿好线的冷压铜端头放入钳口内，用手紧握钳柄，直到压接钳口闭合后，将手松开，压接钳应能自动紧开，此时压接完成。本方法简便易行，但是，使用此方法操作者必须有足够腕力且被压接铜线截面积宜在10MM2以下。机械压接钳及74MM2铜线连接线示意图如图36、37所示。2）第二种方法是用快速液压钳进行压接，找到适合于该规格压接端子的钳口模块，将模块放到钳口内，拧紧放气螺丝，把要压接的端子放置于模块缺口内，这时，操作液压革手柄，直到液压钳口、模块缺口对齐为止，此时压接完成。将放气螺丝松开，取出压接好连接线，整个制作过程结束。本方法适合用于导线截面积在470MM2之间，适用范围广，压接牢固。图36压接钳示意图图3474MM2连接线示意图3、74MM2铜芯连接线的安装（1）将250MM长的连接线一端连接到匹配变压器V2端子上并用转矩扳手坚固；而连接线中一端经匹配奕压器预留孔与调谐单元端子板近端端子相连接（端子板上预留有M6MM螺栓）并用转矩扳手紧固。（2）将500MM长的连接线一端接到匹配变压器V1端子上并用转矩扳手紧固；而连接线另一端经匹配变压器预留孔与调谐单元端子板远端端子相连接（端子板上预留有M6MM螺栓）并用转矩扳手紧固。如图38所示。图38同一基础桩上设备间连接示意图二、钢轨引接线与调谐单元、空芯线圈及钢轨的连接1、埋设小枕木（1）清理两钢轨轨枕头间石碴，并使其底部平整，底平面距轨底面为250MM。（2）将小枕木（两块）平稳的旋转在两轨枕头之间，使小枕木顶面低于轨底面50MM。小枕木示意如图39、小枕木埋设如图310所示。图39小枕木示意图图310小枕木埋设示意图2、调谐单元与钢轨引接线的安装钢轨引接线为两端带冷压铜端头的钢包铜注油线。与钢轨连接的一端为10MM铜端头，与设备连接的一端为12MM铜端头。钢轨引接线有长度2000MM及3700MM两种。（1）用调谐单元两侧端子板上预留的M12铜螺栓，将引接线两根（2000、3700MM）12MM铜端头一端与之连接在一起，并用转矩扳手紧固。（2）将2000MM引接线从调谐单元端子板一侧呈小圆弧状引出，用小枕木卡具固定后，用钢轨卡具固定在内轨轨底面上，将10MM塞榝自钢轨内侧向外侧经塞钉帽（塞钉帽在钢轨上的孔内）穿出，把引接线一端10MM铜端头连接到塞钉上，并用转矩扳手紧固；使引接线朝下与水平面成4560夹角，如图311所示。（3）将3700MM引接线从调谐单元端子板一侧呈小圆弧状引出用小枕木卡具固定后，将引接线沿轨枕侧面穿到线路外侧，引接线在两轨之间部分，用两套轨枕卡具固定；外轨外侧部分用钢轨卡具固定。将10MM塞钉自钢轨内侧向外侧经塞钉帽（塞钉帽在钢轨上的孔内）穿出，把引接线一端的10MM铜端头连接到塞钉上，并用转矩扳手紧固，使引接线朝下并与水平面成4560角。（4）引接线从调谐单元端子板两侧引出，用尼龙拉扣平行绑孔。3、空芯线圈引接线的安装参照调谐单元引接线的安装方法施工。三、各种卡具的安装各种卡具、螺栓、螺母、垫片、应采用镀锌材料1、小枕木卡具用小枕木卡具及其配套螺母，垫片，弹簧圈将引接线固定在小枕木上。注意引接线在小枕木上安装不能盘圈。如图312所示。2、轨枕卡具在两钢轨间的引接线可采用下面三种方法固定（1）将轨枕两侧底部石碴清理干净，将轨枕卡具固定在轨枕侧面，引接线固定在卡具上。如图313所示。（2）将轨枕卡具用6MM胀管螺栓固定在轨枕侧面，卡具用小枕木卡具即可。经轨枕的引接线用其卡具及配套螺丝固定在轨枕侧面。（3）钢轨卡具将引接线固定在钢轨轨底上部。如图314所示。图312小枕木卡具安装示意图图313轨枕卡具安装示意图图314钢轨卡具安装示意图第四章机构绝缘节设备安装第一节机构绝缘节处设备布置一、机构绝缘节处设备机械绝缘节处设备布置如图41所示。图41机械绝缘节处设备布置示意图二、设备的组成设备的组成见表41表41机械绝缘节处设备表序号名称规格单位数量备注1调谐单元ZWT1台1F11700HZ、2000HZ、F22300HZ、2600HZ2空芯线圈ZPWXKJ台11700HZ、2000HZ、2300HZ、2600HZ3匹配变压器ZPWBP台14钢轨引接线2000MM根2钢包铜注油线5钢轨引接线3700MM根2钢包铜注油线6设备与设备连接线2700MM根274MM2多股铜缆7防护盒台2双体防护盒8小枕木块19设备基础桩根210小枕木卡具个211钢轨卡具个212轨枕卡具个2第二节设备安装一、调谐单元（及空芯线圈）、匹配变压器防护盒的定位1、电气化区段调谐单元（及空芯线圈）、匹配变压器防护盒安装标准（1）扼流变压器箱中心（站外侧扼流变压器箱）距调谐单元（空芯线圈）防护盒中心为700MM（列车反向运行方向）；防护盒内侧边缘距所属线路中心不得小于2220MM。（2）匹配变压器防护盒中心距调谐单元（及空芯线圈）防护盒中心为700MM（列车反向运行方向）；防护盒内侧边缘距所属线路中心不得小于2220MM。2、非电气化区段调谐单元（及空芯线圈）、匹配变压器防护盒安装标准（1）调谐单元（及空芯线圈）防护盒中心距机械绝缘节中心为700MM，防护盒内侧边缘距所属线路中心不得小于2220MM。如图41机械绝缘节处设备布置示意图所示。（2）匹配变压器防护盒中心距调谐单元（及空芯线圈）防护盒中心为700MM、防护盒内侧边缘距所属线路中心不得小于2220MM。如图41机械绝缘节处设备布置示意图所示。二、基础安装调谐单元（及空芯线圈）、匹配变压器基础安装参照第三章第二节中的（二）基础安装方法安装。三、调谐单元、空芯线圈的安装1、调谐单元应面向所属线路侧立式安装。2、空芯线圈应采用ZPWXKJ与电气绝缘节使用的空芯线圈不同,面向大地侧立式安装。3、调谐单元与空芯线圈应是背靠背安装。4、用两套配套螺栓（M10）将调谐单元、空芯线圈安装固定在同一基础桩的固定板上，并用转矩扳手将其紧固。调谐单元、空芯线圈安装如图42所示。四、匹配变压器的安装1、匹配变压器应面向在寺立式安装。2、用两套配套螺栓（M10）将匹配变压器安装固定在基础压的固定板上，并用转矩扳手将其紧固。匹配变压器安装如图43所示。五、调谐单元（及空芯线圈）、匹配变压器防护盒的安装参照第三章第二节中的（五）调谐单元（匹配变压器）、空芯线圈防护盒的安装方法施工，安装示意图如图44所示。第三节引接线与设备的连接及安装一、钢轨引接本与调谐和单元、空芯线圈及钢轨的连接1、埋设小枕木参照第三章第三节的（三）埋设小枕木方法施工。2、调谐单元、空芯线圈引接线的安装（1）从调谐单元、空芯线圈两端子板上各连接一根冷压铜端头为12MM引接线（站口用2000MM、3700MM引接线各两根），并用转矩扳手将其紧固。（2）将引接本从调谐单元、空芯线圈两端（双本）呈小圆弧状引出，引出部分用尼龙拉扣绑扎，并分别在小枕木上固定。（3）将两根2000MM钢轨引接线（调谐单元、空芯线圈各一根）在内轨外侧的部分用钢轨卡具固定。将加长塞钉（因为此塞钉上要连接两个铜端头）自网轨内侧向钢轨外侧经塞钉帽穿出，将两根引接本一端的10MM冷压铜端头在塞钉上安装有两种方法一种是采用背靠背方式，而别一种是采用顺向方向（但要求两铜头移开一定角度）；但无论那种方式安装部要保证两个10MM冷压铜端头之间紧密接接触。引接线与钢轨水平方向应成4560夹角。（4）将两根3700MM钢轨引接本（调谐单元、空芯线圈各一根）在小枕木上固定后，将钢轨引接本沿轨枕侧面穿到线路外侧，引接本在两轨之间部分，用两套轨枕卡具固定；外轨外侧部分用钢轨卡具固定。用加长塞钉（因为此塞钉上要连接两个铜端头）自钢轨内侧向钢轨外侧经塞钉帽穿出，将两根引接本上的10MM冷压铜端头分别连接到加长塞钉上，并用转矩扳手将其紧固。两个10MM冷压铜端头在塞钉上安装方法与上述2000MM钢轨引接线的安装方法相同。如图46所示。上面介绍的是ZPW2000自动闭塞调谐单元（及空芯线圈）的设备引接线与钢轨在机械绝缘节（站口）处的连接方式，此种连接方式是与UM71及UM2000不同的。在京山线、沉山线等UM71制式中，机械绝缘节（站口）处的调谐单元（及空世线圈）引接线安装，是将调谐单元端子板与空芯线圈端子板用35MM2铜缆连接线（长180MM）连接并紧固在一起。从调谐单元设备端子板上引出设备引线（70MM2铜缆两端为12MM的冷压铜端头）连接到扼流压器箱的端子上，再由扼流变压器的端子连接线连线至钢轨上。（在电化区段因为站口有扼流变压器箱）第五章补偿电容的安装一、补偿电容1、外形尺寸如图51所示。图51补偿电容外形图2、补偿电容的定位（1）轨道电路长度的计算1）轨道电路长度为电气绝缘节中空芯线圈中心到另一电气绝缘节中空芯线圈中心的距离，或者从机械绝缘节（站口）到电气绝缘中空芯线圈的距离。2）本区段轨道电路补偿长度为L调轨道电路长度（L）29MM（电气绝缘节到电气绝缘节），或L调轨道电路长度（L）145M（电气绝缘节到机械绝缘节）。（2）补偿电容等间距长度的计算1）无绝缘轨道电路闭塞分区内电容的容量、数量和轨道电路长短及道碴电阻大小等因素有关。2）根据道碴电阻和轨道电路的实际长度从表53中查出本区段使用电容的数量NC和容量。3）补偿电容等间距长度L调/NC。表52补偿电容安装工具序号名称规格单位数量1发电机台12电钻台13钻头98MM盒14线路里程测距走行车台15钢尺50M把16直尺250MM把17手捶把18扩眼铳子个19小工具套110通信工具台根据情况定11防护旗红、黄面根据情况定12号眼铳子个113扁铲把114补偿电容套14）半间距是调谐单元与第一个电容之间的距离。半间距/2。如图52所示。图52补偿电容布置示意图3、塞钉孔的测量及定位（1）根据补偿电容等间距及半间距，用线路里程走行测距车（或钢尺）从进站（或出站）口开始测量（以调谐单元钢轨连接线安装位置为起点）。（2）当钻孔位置确定后，检查孔眼是否在两轨枕中间，若不在两轨枕中间，可进行如下调整；半间距（/2）为025MM，等间距（）为05M，以保正钻孔位置在两轨枕中间，以利于钻孔和安装电容。（3）在确定的钻孔位置用直尺、角尺量出钢轨轨腰中部并用红油漆及画笔做好标记。钢