06电泳技术和常用电[临床检验仪器]精品课件（可编辑）

第六章电泳技术和常用电泳仪第六章电泳技术和常用电泳仪一、概述GENERALIZATION电泳（ELECTROPHORESIS）是指带电荷的溶质或粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。利用电泳现象将多组分物质分离、分析的技术叫做电泳技术（ELECTROPHORESISTECHNIQUE）。可以实现电泳分离技术的仪器称之为电泳仪（ELECTROPHORESISTER）。第六章电泳技术和常用电泳仪目前，电泳技术已广泛用于蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、无机离子等成份的分离和鉴定，甚至还用于细胞与病毒的研究。临床常用的电泳分析方法主要有醋酸纤维素薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和毛细管电泳等。第一节电泳原理一、电泳的基本原理物质分子在正常情况下一般不带电，即所带正负电荷量相等，故不显示带电性。但是在一定的物理作用或化学反应条件下，某些物质分子会成为带电的离子（或粒子），不同的物质，由于其带电性质、颗粒形状和大小不同，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此可使它们分离。第一节电泳原理若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为F引EQ（61）在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻F阻6RV（62）当F引F阻时EQ6RVVEQ/6R（63）由上式可以看出,粒子的移动速度泳动速度V与电场强度E和粒子所带电荷量Q成正比,而与粒子的半径R及溶液的粘度成反比。第一节电泳原理二、影响电泳的外界因素（一）电场强度（二）溶液的PH值（三）溶液的离子强度（四）电渗作用（五）粒子的迁移率（六）吸附作用第二节常用电泳技术和电泳方法一、电泳技术的分类（一）根据工作原理的不同可分为移界电泳、区带电泳、等速电泳、等电聚焦电泳、免疫电泳等。（二）根据有无固体支持物可分为自由电泳和支持物电泳第二节常用电泳技术和电泳方法（三）根据支持载体的位置或形状可分成水平电泳、垂直电泳、板状电泳、柱状电泳、U型管电泳、倒V字形电泳、毛细管电泳等。（四）根据支持物的特点又可分为无阻滞支持物电泳。高密度的凝胶电泳。（五）根据电源控制的不同，一般可分为以下3类1恒压电泳2恒流电泳3恒功率电泳。第二节常用电泳技术和电泳方法第二节常用电泳技术和电泳方法二、电泳方法简介（一）纸电泳指用滤纸作为支持载体的电泳方法。是最早使用的区带电泳。第二节常用电泳技术和电泳方法（二）醋酸纤维素薄膜电泳电泳时经过膜的预处理、加样、电泳、染色、脱色与透明即可得到满意的分离效果。此电泳的特点是分离速度快、电泳时间短、样品用量少。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。第二节常用电泳技术和电泳方法（三）凝胶电泳由区带电泳中派生出一种用凝胶物质作支持物进行电泳的方式，被称为凝胶电泳。普通的凝胶电泳在板上进行，以凝胶作为介质。电泳中常用的凝胶为葡聚糖、交联聚丙烯酰胺和琼脂糖。它具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小1100G）、分辨率高等优点。第二节常用电泳技术和电泳方法（四）等电聚焦电泳1等电聚焦电泳过程一种利用有PH值梯度的介质，分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。第二节常用电泳技术和电泳方法2等电聚焦电泳的特点使用两性载体电解质，在电极之间形成稳定、连续、线性的PH梯度；由于“聚焦效应”，即使很小的样品也能获得清晰、鲜明的区带界面；电泳速度快分辨率高加入样品的位置可任意选择；可用于测定蛋白质类物质的等电点适用于中、大分子量（如蛋白质、肽类、同工酶等）生物组分的分离分析。第二节常用电泳技术和电泳方法（五）等速电泳采用两种不同浓度的电解质组成，一种为前导电解质，充满整个毛细管柱；另一种为尾随电解质，置于一端的电泳槽中。前导电解质的迁移率高于任何样品组分，后者则低于任何样品组分，被分离的组分按其不同的迁移率夹在中间，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中移动，实现分离。第二节常用电泳技术和电泳方法（六）双向凝胶电泳（二维电泳）第一向采用等电聚焦根据复杂的蛋白质成分中各个蛋白质的PI的不同，将蛋白质进行分离。第二向采用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）就是按蛋白质分子量的大小使其在垂直方向进行分离。其结果不再是条带状，而是呈现为斑点状。第二节常用电泳技术和电泳方法第二节常用电泳技术和电泳方法七）免疫役电泳免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开，然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。第三节常用电泳设备的基本结构及技术指标一、常用电泳设备的基本结构（一）电泳电源（二）电泳槽（三）附加装置第三节常用电泳设备的基本结构及技术指标二、电泳仪的主要技术指标1输出电压8连续工作时间2输出电流9保护措施3输出功率10显示方式4电压稳定度11定时方式5电流稳定度12电源电压6功率稳定度13电源频率7输出组数14功耗第四节毛细管电泳的基本结构和分离模式一、毛细管电泳的相关概念1电场强度（ELECTRICFIELDSTRENGTH）2电泳淌度ELECTROPHORETICMOBILITY3迁移时间（MIGRATIONTIME）4电泳速度ELECTROPHORETICVELOCITY5电渗流（ELECTROOSMOTICFLOW，EOF）6焦耳热（JOULEHEATING）第四节毛细管电泳的基本结构和分离模式二、毛细管电泳的基本工作原理溶液中的带电粒子以高压电场为驱动力，沿毛细管通道，以不同速度向与其所带电荷相反的电极方向迁移，并依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离。第四节毛细管电泳的基本结构和分离模式0609毛细管电泳仪装置示意图第四节毛细管电泳的基本结构和分离模式三、毛细管电泳的特点1高灵敏度2高速度3高分辨率4样品少5自动化程度高6应用范围广第四节毛细管电泳的基本结构和分离模式四、毛细管电泳的分离模式（一）毛细管区带电泳它是通过在充满电解质溶液的毛细管中，不同质荷比大小的组分在电场的作用下，依迁移速度的不同而进行分离的。根据组分的迁移时间进行定性，根据电泳峰的峰面积或峰高进行定量分析。第四节毛细管电泳的基本结构和分离模式（二）毛细管凝胶电泳将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性，起类似分子筛的作用，能根据待测组分的质荷比和分子体积的不同而进行分离。适用于分离、测定肽类、蛋白质、DNA类物质的分离。第四节毛细管电泳的基本结构和分离模式（三）毛细管胶束电动色谱MECC使MECC系统中存在两个相流动的水相和起到固定相作用的胶束相。在含有胶束的流动相中，溶质在“水相”和“胶束相”准固定相之间进行分配，即使是中性溶质，因其本身疏水性不同，在二者之间的分配也会有差异，疏水性强的溶质在“胶束相”中停留时间长，迁移速度就慢。反之，亲水性强的溶质迁移速度就快，最终中性溶质将依其疏水性不同而得以分离。第四节毛细管电泳的基本结构和分离模式第四节毛细管电泳的基本结构和分离模式（四）毛细管等电聚焦电泳不同等电点的分子分别聚集在不同的位置上，不作迁移而彼此分离，这就是等电聚焦分离过程。毛细管的等电聚焦是在毛细管内实现的等电聚焦过程，具有极高的分辨率，通常可以分离等电点差异小于001PH单位的两种蛋白质，例如肽类、蛋白质的分离。第四节毛细管电泳的基本结构和分离模式（五）毛细管等速电泳毛细管内首先导入具有比被分离各组分高电泳淌度的前导电解质，然后进样，随后再导入比各分离组份低电泳淌度的尾随电解质，在强电场的作用下，各被分离组分在前导电解质与尾随电解质之间的空隙中发生分离。第四节毛细管电泳的基本结构和分离模式（六）毛细管电色谱它包含了电泳和色谱两种机制，是在毛细管中填充或在毛细管壁上键合（或涂壁）固定相，从而构成毛细管色谱柱，依靠电渗流推动流动相，携带样品迁移，根据样品分子的质荷比、分子尺寸及分配系数的差别而分离。第四节毛细管电泳的基本结构和分离模式五、毛细管电泳仪的基本结构毛细管电泳仪的结构并不复杂，主要有高压源、毛细管柱、检测器，以及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液槽。（一）毛细管柱（二）检测器（三）毛细管电泳法的进样技术第四节毛细管电泳的基本结构和分离模式六、常用各种电泳仪简介（一）稳压稳流电泳仪稳压稳流电泳仪是中压电泳仪。其输出电压的调节范围为0V600V、输出电流为0MA100MA。该机工作稳定性好、调节范围宽，并设有完善的短路保护电路和过流保护电路，是目前国内中、低压电泳实验中应用最广泛的电泳仪之一。第四节毛细管电泳的基本结构和分离模式（二）全自动醋纤膜电泳仪全自动醋纤膜电泳仪为全自动电泳仪，有可见光单系统，使用醋酸纤维薄膜电泳片，优点为自动化程度高。只需将样品、试剂、电泳片放好，人员可离机完成实验并得到结果。第四节毛细管电泳的基本结构和分离模式（三）全自动荧光/可见光双系统电泳仪全自动荧光/可见光双系统电泳仪为全自动电泳仪，具有荧光/可见光双系统，在使用荧光试剂项目如CK、LD同工酶时为全自动。只需将样品、试剂、琼脂糖凝胶电泳胶片放好后，操作人员可离机完成实验并得到结果。第四节毛细管电泳的基本结构和分离模式（四）全自动琼脂糖电泳仪全自动电泳仪，有可见光单系统，使用琼脂糖凝胶电泳胶片，优点为灵敏度高，可适用于低浓度蛋白检验。该仪器自动化程度较差，当电泳结束和染色脱色完成后，工作人员必须将电泳片