fgf23过表达经磷介导引起中枢神经系统和心血管系统功能异常

南京医科大学博士学位论文FGF23过表达经磷介导引起中枢神经系统和心血管系统功能异常姓名刘培党申请学位级别博士专业人体解剖与组织胚胎学指导教师王鹤鸣苗登顺20080510南京医科大学博士学位论文缩写词南京医科大学博士学位论文南京医科大学博士学位论文论文独创性声明本论文至鲤三过塞达经盛企昱曼起生抠益经丕统塑堂鱼篁丕统功能昱监是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均在论文中作了明确的声明并表示了谢意。目前本论文中所有数据均尚未发表，未经允许不得用作他途。日期坦生坐论文使用授权声明本人完全了解南京医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名挚导师签名南京医科大学博士学位论文过表达经磷介导引起中枢神经系统和心血管系统功能异常博士研究生刘培党导师王鹤鸣教授苗登顺教授中文摘要成纤维细胞生长因子（）属于亚科，是多肽激素家族的新成员。蛋白由个氨基酸残基组成，其氨基端的个氨基酸形成信号肽，因此，属于分泌型蛋白。作为重要的调磷因子，过表达能导致低磷血症。磷是体内许多生理过程中必不可少的元素，磷的降低会导致细胞能量代谢和递质功能异常，长期重度低磷血症对心、脑功能产生明显影响。另外，还可与受体（）结合发挥其直接作用。体外研究证实与的亚型以及结合并激活受体，在体内则需要蛋白作为辅助受体。原位杂交结果表明在成年小鼠丘脑腹外侧核表达，提示参与脑的正常生理功能。目前，对的研究热点主要集中在其调磷机制上，而对肾、骨以外的器官的研究报道较少为了研究过表达在中枢神经系统（）和心血管系统（）中的作用，我们利用功能分析、组织形态学和分子生物学的方法，比较分析了周龄同窝过表达人（）的转基因（）和野生型（）小鼠的和的表型差异。在，水迷宫检测结果显示，小鼠的空间学记忆功能明显降低，说明过表达能够对的功能产生影响。电生理学南京医科大学博士学位论文结果表明，给予高频强直刺激不能诱导小鼠海马区兴奋性突触后电位的增加，提示过表达引起长时程增强诱导障碍。胆碱乙酰转移酶（免疫组化染色发现，小鼠基底前脑阳性细胞数目较小鼠明显降低。这些结果提示海马突触可塑性受损以及基底前脑胆碱能神经元数目的减少可能与学习记忆功能障碍有关。对脑的整体观察没有发现脑形态的异常。通过增殖细胞核抗原（）、免疫组化染色，没有发现和阳性细胞数目在小鼠和小鼠之间存在明显差异，说明过表达没有对神经细胞增殖和凋亡产生明显影响。神经元特异性核蛋白（）和钙结合蛋白免疫组化结果显示，小鼠与小鼠相比，阳性结构以及钙结合蛋白阳性产物面积无明显差异，提示过表达对神经元的成熟以及向中间神经元和投射神经元的分化无明显影响。胶质纤维酸性蛋白（）牙口髓鞘碱性蛋白）免疫组化结果显示，和阳性结构在小鼠与小鼠之间无明显差异，提示过表达也不影响星形胶质细胞和少突胶质细胞的分化。在，尾动脉血压检测结果发现小鼠收缩压显著降低，说明过表达也引起了功能异常。放免检测发现，血浆儿茶酚胺和肾素一血管紧张素系统（）水平上调。超声心动图检查结果揭示，小鼠左心室肥大，但心功能没有明显变化。离体主动脉环实验结果显示，小鼠主动脉环对去甲肾上腺素和血管紧张素的收缩反应性下降，而对的收缩反应性不变，说明过表达导致血管对缩血管药物的反应性降低。实时荧光定量研究数据显示，与小鼠相比，南京医科大学博士学位论文小鼠的主动脉肾上腺素能受体【的三种亚型和血管紧张素受体在小鼠主动脉的表达水平显著降低，提示过表达导致缩血管相关分子受体下调。这些结果说明过表达引起了收缩压的降低；低血压的形成和持续可能与血管顺应性降低、肾上腺素能受体和血管紧张素受体的减少有关；低血压导致机体出现保护性反应，表现在左心室代偿性肥大、血浆儿茶酚胺和水平上调。为了明确过表达引起的和功能异常是通过磷介导，还是通过复合受体介导，我们对周龄同窝过表达人（）的和小鼠进行为期周的高磷饮食（含磷）喂养，并对和的表型进行了分析。结果表明，给予高磷饮食后，小鼠的低磷血症得到改善，脑和心血管系统的表型也得到了矫正。根据我们的研究结果，我们得出以下结论（）过表达能够引起和功能异常，导致空间学习记忆功能降低和低血压；（）过表达对空间学习记忆功能和血压的影响是通过低磷血症介导，而不是通过其和中的受体介导的直接作用的结果。关键词成纤维细胞生长因子；低磷血症；中枢神经系统；心血管系统；转基因小鼠模型南京医科大学博士学位论文。（）一，一一，（），一，一南京医科大学博士学位论文，一（），一，一（），（）一（）（），一，一，（）南京医科大学博士学位论文（）一，一如一，（）（），一（），恚椋睿澹，南京医科大学博士学位论文一争玎，一一，（），（）一（）一，南京医科大学博士学位论文；南京医科大学博士学位论文引言脑是人类精神和智力活动的器官，是人类一切活动的中枢。脑的健康与否不但决定着人们的生命，更重要的是决定着人们的生存质量。因此，对脑的研究已成为生命科学中的持续热点。分子生物学的奠基人之一，诺贝尔奖获得者沃森更是宣称“世纪是脑的世纪”。脑内神经细胞对维持脑的正常生理功能发挥着重要作用。对成体中枢神经系统（）内具有增殖、分化能力的神经细胞脑区，如脑室下区（，）、海马齿状回（，）、大脑皮质以及纹状体等的研究发现，这些神经生发区在生后脑的再生和在脑损伤修复中发挥重要作用。特定生发脑区内神经细胞增殖、分化、凋亡过程受到内、外源性细胞因子和微环境的调控。成纤维细胞生长因子（，）是一类调节细胞生长的多功能肽类生长因子。迄今为止，已发现种不同的，它们在正常组织效应细胞均具有特异性受体，即成纤维细胞生长因子受体（，）。通过与细胞膜上受体的结合对许多生理及病理过程发挥作用，包括胚胎发育、细胞生长、组织形成和修复、炎症、肿瘤发生与转移等。近年来，通过对的研究表明，许多参与的发生、发育及损伤后修复等过程一，因此，对中枢神经系统的作用越来越受到刖门的关注。成纤维细胞生长因子（）是多肽激素成纤维细胞生长因子家族的新成员，是近年来发现的一种新型调磷因子（）。许多研究。证实是连锁低磷血症性佝偻病骨软化症（）、常染色体南京医科大学博士学位论文显性遗传性低磷血症性佝偻病（删和肿瘤诱发的骨软化症（）等低磷血症性佝偻病骨软化症的共同致病因子它不仅在磷平衡和维生素代谢的生理性调控中起重要作用，而且在墁性肾脏疾病（），特别是伴发继发性甲状旁腺功能亢进的发病机制中起关键作用。采用原位杂交的方法检测出在成年小鼠丘脑腹外侧核表达，提示参与脑的正常生理功能。但对脑功能和结构的影响国内、外未见报道。过表达人（）的转基因小鼠，肝脏产生，作为重要的调磷因子，。能导致低磷血症（）。磷是细胞新陈代谢必需的基本元素，在信号传导、核苷代谢、酶调节等过程中发挥重要作用，磷的降低会导致细胞能量代谢和递质功能异常。，长期重度低磷血症（）对心、脑功能产生明显影响。过表达人的转基因小鼠脑部较小，生长迟缓，且生后个月内死亡，提示这不是低磷单独作用的结果，在其中可能发挥重要作用。作为一种小分子量物质，能通过血脑屏障（）进入脑内，与其高亲和力受体（）结合从而发挥功能效应。体外研究证实成熟的人全段与，和（而不是亚型）以及结合并激活受体在七种中，和在成体脑内大量表达，其中在神经元表达，在少突胶质细胞表达，而在星形胶质细胞和小胶质细胞表达。这说明通过与不同的结合从而对不同的神经细胞产生功能作用。亚型以及在心血管系统（）中亦有广泛表达”。新近等在（）上撰文指出蛋白（一种抗衰南京医科大学博士学位论文老基因产物腓为的共同受体促进与、和结合。这说明和的共表达决定着一的靶器官。鉴于的广泛表达，因此，寻找的高表达部位便成为寻找靶器官的一条有效途径。已有的研究证实在肾脏、垂体、脉络丛、窦房结、甲状旁腺中高表达，那么，体内还有哪些组织、器官高表达蛋白呢根据我们的前期研究结果，我们提出过表达能够影响和功能和结构，而这种影响是通过受体介导和或经细胞外磷介导为了验证我们的设想，我们利用过表达人（）的转基因小鼠，分别给予正常饮食和高磷饮食，采用分子生物学和神经生物学相结合的方法，比较分析了不同饮食周龄野生型和转基因小鼠和的表型差异，以明确过表达对和的影响是经过其受体介导的直接作用，还是低磷血症介导的间接作用的结果。本研究将为、等疾病的治疗提供实验和理论依据。南京医科大学博士学位论文第一部分过表达经磷介导引起中枢神经系统功能异常材料与方法实验动物及分组本研究中所有实验小鼠均由南京医科大学级实验动物中心饲养，采用转基因雄鼠和野生型雌鼠配对饲养，所有仔鼠的基因型通过剪尾（）提取进行扩增鉴定。天分笼时实验动物分别给予正常饮食和高磷饮食（的磷溶入饮水中）喂养，周龄时用于实验研究。除特殊说明所用动物数量之处，本研究中每种实验所用动物均为四组，即正常饮食野生型（）、正常饮食转基因（）、高磷饮食野生型（）以及高磷饮食转基因（），同种饮食的和采用同窝同性别配对，每组为只小鼠，共只。动物基因型鉴定）主要仪器（）低温离心机（一型，德国公司）（）精密电子天平（，型，德国公司）（）超纯水机（型，英国公司）（）全自动高压蒸汽灭菌锅（型，韩国公司）（）梯度义（型，美国公司）（）其余如制冰机、摇床、恒温水浴锅、微波炉、核酸电泳系统、数码凝胶成像与分析系统等均为国产仪器。南京医科大学博士学位论文）主要试剂（）鼠尾溶解液溶解液中含、，室温保存。（）蛋白酶溶液取蛋白酶，加去离子水吏成，分装后冻存于”，用时溶解。（）苯酚氯仿异戊醇（）溶液取聪平衡酚（中国医学科学院生物工程研究所产口），氯仿，异戊醇加入棕色试剂瓶中混匀，”避光保存。（）正向引物；反向引物，扩增片段长度为。引物由上海公司合成。（）混合液、酶、等为司产品。琼脂糖、溴乙锭等均为国产）实验步骤（）溶解鼠尾向（）管中加入“鼠尾溶解液扣蛋白酶“，置摇床中转份钟，孵育过夜直至鼠尾完全溶解。（）每管中加入“苯酚氯仿异戊醇（）溶液，剧烈振荡秒，室温静置分钟。（）置离心机中转份钟离心分钟使液体分为三层（）取上层无色水相液体约“于新管中，注意勿吸取中层液体。南京医科大学博士学位论文（）向新管中加入无水乙醇后，轻轻颠倒次直至看到絮状沉淀产生。（）置离心机中转分钟离心分钟。（）弃去液体，倒置管于吸水纸上，室温干燥约分钟。（）每管中加“无菌蒸馏水后，置。浴小时以溶解。（）反应体系（）（）反应条件（）产物电泳南京医科大学博士学位论文配制琼脂糖凝胶称取琼脂糖，加入的缓冲液中，混匀，放入微波炉中加热，直至