天津地区糖尿病肾病易感基因研究(可编辑)

天津地区糖尿病肾病易感基因研究天津医科大学硕士学位论文天津地区糖尿病肾病的易感基因研究姓名李然申请学位级别硕士专业临床医学内科学肾内科指导教师韩鸿玲201205天津医科大学硕士学位论文中文于葡要目的糖尿病肾病是糖尿病重要的微血管病变,是糖尿病死亡的主要原因之一,也是导致终末期肾损言的重要原因。糖尿病肾病发病机制复杂,糖脂代谢紊乱、氧化应激、肾素血管紧张素系统、足细胞屏障功能、炎症反应、上皮细胞间叶细胞转化及细胞因子等均可影响肾脏病变。研究表明遗传因素在发病中发挥重要作用,从群体水平探讨的遗传易感性具有十分重要的意义。本研究选取与发病机制相关的个基因个位点进行基因分型,以此对糖尿病肾病发病进行关联分析,并探索基因型交互作用在糖尿病肾病发病中的作用。方法收集名中国北方天津地区汉族型糖尿病患者,样本分别来自天津医科大学总医院、天津医科大学代谢病医院、南开大学人民医院。收集患者的一般资料及临床生化指标,包括年龄、体重、血糖、血肌酐、白蛋白等。按是否伴发糖尿病肾病分为糖尿病肾病组和非糖尿病肾病组,以糖尿病病程大于年,无糖尿病肾病无糖尿病视网膜病变患者作为糖尿病肾病组的对照组采用高盐法原平皓公司试剂盒提取患者外周血白细胞基因组,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术,对例天津地区的型糖尿病患者的个基因个位点进行基因分型,应用统计软件对样本进行描述流行病学分析和数据整理,然后应用软件做基因型表型的关联分析及基因型交互作用分析。结果以糖尿病病程超过年,无糖尿病肾病无糖尿病视网膜病变患者作为对照,基因的、与糖尿病肾病存在关联,特别是基因的位点与糖尿病肾病存在显著关联。与对照组相比,基因的位点与糖尿病肾病发病相关联位点与糖尿病。与对照组相比,/基因的肾病存在关联。所测个基因个位点在糖尿病肾病发病中未见明显交互作用。结论遗传因素在糖尿病肾病发生中起重要作用,基因、基因及/基因的多态性与糖尿病肾病发病相关,、基因所测位点与天津地区型糖尿病肾病不相关。关键词糖尿病肾病单核苷酸多态性关联分析基因交互作用,。舶鹏,嘶,珊,。,天津医科大学硕士学位论文/,、/,/天津医科大学硕士学位论文缩略语/符号说明糖尿病肾病终末期肾脏疾病全基因组关联分析单核细胞趋化蛋白趋化因子受体细胞外基质肾小管间质纤维化非肌肌球蛋白局灶节段性肾小球硬化上皮细胞问充质转分化转化生子因子血小板衍生生长因子糖尿病微血管病变岩藻糖基转移酶基质金属蛋白酶肿瘤坏死因子白细胞介素单核苷酸多态性尿白蛋白排泄率磷酸盐缓冲液最小等位基因频率肾小球滤过率肾素血管紧张素醛固酮系统血管紧张素转化酶血管紧张素原过氧化物酶增殖体活化受体内皮型一氧化氮合酶血管内皮生长因子天津医科大学硕士学位论文一一糖基化终末产物醛糖还原酶山梨醇脱氢酶蛋白激酶天津医科大学硕士学位论文三一一日吾研究现状、成果糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症之一,糖尿病患者中约发展为糖尿病肾病。糖尿病肾病是糖尿病死亡的主要原因之一,也是导致终末期肾病,的重要原因。据报道,在欧美国家,终末期肾病约有/为糖尿病所致,且为型糖尿病。糖尿病是常见病、多发病,其患病率随着人民生活水平的提高、生活方式的改变而迅速增加。近年来,我国糖尿病患病率显著增高,全国省市万人流行病学资料显示为,年,年岁以上的人口中,城市糖尿病的患病率升高到,至年,中国成人糖尿病总数达万,我国可能已成为糖尿病人数最多的国家。随着糖尿病患病率的升高,糖尿病肾病的患病率亦随之增高,有报道在糖尿病发病年后,患者出现糖尿病肾病【,因此研究糖尿病肾病的发病机制具有重要意义。糖尿病肾病发病机制复杂,遗传因素、肾脏血流动力学异常、糖脂代谢紊乱、炎症反应、氧化应激等多种因素参与糖尿病肾病的发病。糖尿病肾病具有明显的遗传倾向,环境和遗传因素的交互作用决定了的易感性,而遗传因素在的发生、发展过程中起着更为重要的作用。流行病学资料显示糖尿病肾病具有家族聚集现象【】,且不同种族间糖尿病肾病的发生率也明显不同,印第安人糖尿病患者中糖尿病肾病发生率高达,而一般白种人则为左右。随着,的广泛应用,糖尿全基因组关联分析病肾病的遗传学背景得到逐步认识。全基因组关联分析是指采用高通量的基因分型技术,对覆盖全基因组的遗传标记进行基因分型,通过病例对照研究或基于家系的关联分析来寻找全基因组中与疾病性状相关的基因,目前多用于复杂遗传疾病的研究,包括肿瘤、精神病及糖尿病等多基因遗传疾病。迄今为止,已发现多个基因与糖尿病肾病密切相关,包括、等基因。目前国内对糖尿病肾病基因研究大多是通过病例对照研究对单个基因多态性与关系进行分析,由于糖尿病肾病是多基因遗传疾病,在群体水平上单个基因的作用是有限的,单基因突变造成的例子及其罕见。在多基因遗传病中,遗传因素的总体作用不等于单个基因的作天津医科大学硕士学位论文用相加,也就是说,存在基因之间的协同作用。基因型交互作用反映了在群体水平上对某种疾病的易感性,而生物学上的交互作用为基因研究提供一定参考,本研究从影响糖尿病肾病发病机制着手,研究多个基因与糖尿病肾病的关系及基因间的交互作用。糖尿病肾病肾脏病理改变以肾小球系膜扩张、细胞外基质积聚、基底膜增厚及肾小球硬化为特征,细胞外基质,积聚包括在肾小球系膜区和肾小管间质区的聚集。肾小管间质纤维化,是所有慢性肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的共同通路,也是进展期糖尿病肾病的重要特征。高糖刺激氧化应激、病理性血管生成、肾素血管紧张素系统等异常导致肾脏血流动力学改变,肾小球高滤过,基底膜增厚、破坏,尿蛋白排泄增多,刺激前炎症和前纤维化因子一、释放,使炎症细胞主要是巨噬细胞、淋巴细胞的浸润增加及炎症因子的释放,并在炎症因子刺激下激活成纤维细胞导致其增殖分化,使细胞外基质合成增加,最终导致纤维化的发生。氧化应激、血流动力学改变、足细胞功能、炎症细胞浸润、成纤维细胞的增殖、细胞外基质的合成和降解水平都是影响的主要因素,我们推测与以上途径相关的基因可能与糖尿病肾病的发病相关。研究表明长期的高糖刺激会导致氧化应激发生,氧化应激与糖尿病微血管并发症密切相关。动物及体内实验均证明增加肾小球蛋白滤过,而引起系膜增生、肾小球硬化【。细胞内活性氧,的主要来源是线粒体呼吸链,基因编码产物是锰超氧化物歧化酶,它常被转运至线粒体基质清理超氧阴离子自由基,从而保护细胞免受氧化应激损害。多态性位点位于基因外显子,与锰超氧化物歧化酶转运至线粒体基质效率相关,影响细胞抗氧化应激的能力,比抗氧化应激能力更强【】。在丹麦型糖尿病患者中发现,基因多态性与糖尿病肾病密切相关【。【及等分别在日本和韩国型糖尿病肾病患者中发现,基因等位基因频率低于非糖尿病肾病患者,表明基因多态性与糖尿病肾病密切相关。糖尿病肾病早期肾小球高滤过和肾小球肥大与肾小球毛细血管增多有关,缺氧诱导的病理性血管新生通过多种途径参与糖尿病肾病的发生与发展。研究发现血管极处的新生血管使。予球肥大,肾小球毛细血管闭塞、纤维化发生频率增加,肾小管间质损害和尿蛋白排泄增加。糖尿病肾病早期缺氧、高糖刺天津医科大学硕士学位论文激下,表达增高,它可促进内皮细胞增殖抑制细胞凋亡而导致内皮细胞增多引起血管新型”。而在糖尿病肾病晚期却发现肾小球和肾小管周围表达下降,伴随着肾小球和肾小管周围毛细血管的丧失,导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化【。用小剂量处理足细胞特异表达最常见亚型转基因大鼠周后观察到,足细胞丢失、肾小球基底膜增厚、结节性肾小球硬化、微动脉瘤形成,尿蛋白排泄增加,表明局部水平决定糖尿病肾病的严重程度【】。基因多态性与糖尿病肾病密切相关【】,而在中国汉族人中未发现基因的单核苷酸多态性与型糖尿病的相关性【】,由于只是对基因单个位点多态性与糖尿病的关联分析,有必要分析它与多个基因的交互作用。此外与肾脏血流动力学改变密切相关的尚有肾素血管紧张素系统,目前基因与糖尿病肾病中关联被广泛研究,但也有不同甚至相反的研究结果。足细胞屏障功能破坏参与糖尿病。肾病的发生发展。糖尿病肾病早期表现出肾小球足细胞数目及密度的减少,足细胞病变不仅导致大量蛋白尿的发生,而且还与肾小球硬化和肾功能损害有关。非肌肉肌球蛋白重链,是由基因编码的蛋白,是构成上皮细胞完整性的主要成分,基因突变时,不能维持正常足细胞骨架,影响屏障功能,而导致肾脏损害。对欧美例,例没有肾病,例正常人进行的基因分析表明,和与型糖尿病所致终末期肾病易感性相关【引,提示细胞骨架结构改变可影响糖尿病肾病的发生。基因与基因编码的蛋白功能相似,主要功能是通过磷酸化切丝蛋白、蛋白来调节肌动蛋白丝和质膜结构的重新组装,调节肌动蛋白细胞骨架。基因编码蛋白属于激酶家族成员之一,以往研究表明激酶与神经、生殖、心血管系统病变及肿瘤密切相关】。而最近在非裔美籍人型糖尿病所致终末期。肾损害的全基因关联分析中。已证实基因及与之相邻的基因是的关联基因【炎症细胞的浸润是炎症反应的特征性表现之一,也是发生发展的中心环节。在动物模型和人糖尿病肾病活检标本中均发现有巨噬细胞、淋巴细胞在肾小球和肾小管间质浸润,且肾问质纤维化程度与间质内炎症细胞浸润数量显著正相关【。炎症细胞的迁徙与炎症趋化因子/趋化因子受体、整合素如细胞间粘附分子一、单核巨噬细胞趋化蛋白一、选择素选择素、选择素天津医科大学硕士学位论文等密切相关。微炎症状态在糖尿病肾病发病中具有重要作用,且近来的研究表明自身免疫反应亦参与糖尿病肾病的发病。基因在许多免疫相关细胞亚群上均有表达,可调节细胞、自然杀伤细胞和淋巴组织诱导细胞的发展,而参与免疫炎症反应。基因被证实与肿瘤相关,但其是否与糖尿病肾病发病相关尚少见报道。,上皮细胞间叶细胞转化,是糖尿病进展性肾损害的重要环节之一,也是细胞外基质积聚、肾间质纤维化发生发展的核心环节之一。肾小管上皮细胞转分化,即肾小管上皮细胞失去其特有的细胞表型和特征,转化为肌成纤维细胞的过程,主要表现为钙粘素等上皮细胞标志物表达降低或消失,纤维结合蛋白、等间充质细胞标志蛋白表达增高。转化生长因子,是公认的致纤维化因子,它在糖尿病肾病肾组织中表达增高,尤其在间质细胞和近端肾小管上皮细胞。可通过各种信号通路发。此外,挥其对细胞外基质蛋白的影响,使胶原蛋白和纤维连接蛋白表达增加【还可通过减少基质金属蛋白酶和增加组织金属蛋白酶抑制物产生而减少的降解。/通过增加表达使纤连蛋白表达增高,介导糖尿病肾病肾小管间质纤维化【】。可见与糖尿病肾病肾脏纤维化密切相关,在动物实验【及基于家系【】基因研究均表明基因多态性与糖尿病肾病相关。可由肾脏系膜细血小板衍生生长因子胞、集合管上皮细胞分泌产生,主要生理作用是促进细胞合成,诱导细胞进行有丝分裂,促进细胞外基质的积聚,参与糖尿病肾病肾脏纤维化的进展。经典的是由、两个皿基通过二硫键形成的三种不同的二聚体,其中链基因位于号染色体上,由原癌基因编码。限制性敲除小鼠内皮细胞基因,发现周细胞向血管聚集受损,心肾功能异常,与糖尿病微血管病变相关。此外,糖尿病肾病患者肾脏表达水平比非糖尿病肾病患者高,且肾活检组织免疫组织化学染色显示蛋白表达增高,与肾脏纤维化正相关【。综上所述,糖尿病肾病是终末期肾损害的主要原因之一,发病机制复杂,其中遗传因素发挥重要作用。,肾脏纤维化是糖尿病肾病导致终末期肾损害的关键途径,氧化应激、炎症免疫损伤、细胞外基质合成降解失衡、上皮细胞间质天津医科大学硕士学位论文一一型转分化等多种因素均可影响糖尿病肾病发生。故本研究从生物学作用、发病机制出发,拟对糖尿病肾病患者进行多基因关联分析,候选基因包括影响足细胞屏障功能的基因,影响炎症反应的基因及影响上皮细胞间叶细胞转分化的基因,与血流动力学改变相关的基因及基因,与细胞外基质合成相关的基因,氧化应激相关的基因,及抑癌基因/基因,基因,探索这个基因与天津地区型糖尿病肾病的相关性。研究目的、方法目的糖尿病肾病是糖尿病微血管病变之一,也是糖尿病死亡的主要原因之一。遗传因素在糖尿病肾病发生发展中起重要作用,已经发现、等余个基因与糖尿病肾病相关。这些基因的多态性变异可以显著增加糖尿病肾病的发病风险。由于糖尿病肾病有很强的异质性,不同种族、不同人群以及不同的个体间引起病变的基因异常可能均有所不相同,所以本研究希望能找到与天津地区汉族相关的糖尿病肾病易感基因。糖尿病肾病发病机制复杂,氧化应激、肾脏血流动力学改变、足细胞屏障功能、炎症细胞浸润、上皮细胞转分化及细胞因子等均可影响肾脏病变,故本研究选择影响足细胞屏障功能的基因,影响炎症反应的基因及影响上皮细胞问叶细胞转化的基因,还有基因、基因、基因、基因及/基因作为目标基因,并依据连锁不平衡原理,对个候选基因作了个位点的遗传标记,来探讨这些位点的单核苷酸多态性与天津地区汉族人群糖尿病肾病的相关性,探索个基因在糖尿病肾病发病中的交互作用。方法收集名中国北方天津地区汉族患者作为样本,样分别来自天津医科大学总医院、天津医科大学代谢病医院、南开大学人民医院。收集患者的一般资料及临床生化指标,包括性别、年龄、身高、体重、静脉空腹血糖、尿蛋白、血肌酐等资料。按是否伴发糖尿病肾病分为糖尿病肾病组和非糖尿病肾病组,以糖尿病病程大于年,无糖尿病。肾病无糖尿病视网膜病变患者作为糖尿病肾病组的对照组。采用高盐法原平皓公司试剂盒提取周围血白细胞基因组。应用基质辅助激光解吸电离飞行时问质谱技术,对例天津地区的型糖尿病患者的个基因的个位点天津医科大学硕士学位论文进行基因分型,应用统计软件对样本进行描述流行病学分析和数据整理,然后应用软件做基因型表型的关联分析及基因型交互作用分析。天津医科大学硕士学位论文对象和方法研究对象本研究共收集了名中国北方天津地区汉族型糖尿病患者,分别来自天津医科大学总医院、天津医科大学代谢病医院、南开大学人民医院。收集患者一般资料及生化指标年龄、性别、体重、血糖、血脂、病程、尿蛋白定量、血肌酐、血尿酸、总蛋白、白蛋白等临床资料。其中男性例,女性例,平均年龄为士岁。糖尿病肾病患者人,非糖尿病。肾病患者人,其中糖尿病病程年,无糖尿病肾病、无糖尿病视网膜病变患者人。按是否伴发糖尿病肾病分为糖尿病肾病组和非糖尿病肾病组,以糖尿病病程大于年,无糖尿病肾病无糖尿病视网膜病变患者作为糖尿病。肾病组的对照组。糖尿病诊断标准参照年专家委员会公布的协商性报告糖尿病症状加任意时间血浆葡萄糖/,或空腹血糖/,或血糖值/糖尿病肾病诊断标准有糖尿病病史,微蛋白/肌酐/,糖尿病肾病导致的终末期肾损害患者或依据肾穿刺病理诊断为糖尿病肾病患者。所有患者均除外其他继发性肾小球疾病如多发性骨髓瘤肾损害、肝硬化性肾小球硬化症、实体肿瘤相关性肾损害、乙肝病毒相关性肾炎、狼疮性肾炎、类风湿性关节炎肾损害等。糖尿病肾病分期期肾体积增大,增高。期多数年,肾小球基膜增厚,系膜基质增加,尿蛋白排泄率正常,但运动后。期临床早期,上述病变和静息时“咖加重。期临床,出现持续性蛋白尿,/,病理上出现结节,降低而仍可正常,临床上可有高血压及大量蛋白尿。期慢性肾功能衰竭,噌高。仪器与试剂仪器天津医科大学硕士学位论文高速离心机旋涡混合器、为公司移液器、产品微量紫外分光光度计数显电热恒热水温箱试剂全血提取试剂盒购自北京原平皓生物技术有限公司,其试剂主要有红细胞裂解液细胞裂解液裂解白细胞蛋白沉淀液异丙醇乙醇分子生物学软件软件数据库方法临床及生化指标收集患者的一般情况及临床生化指标。一般情况包括性别、年龄、身高、体重、糖尿病病程、糖尿病家族史、吸烟及饮酒史、尿蛋白史、高血压及冠一病病史等。血生化指标,包括血清总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酸转移酶、血尿素氮、血肌酐、血尿酸、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、血钙、血鳞、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、反应蛋白、血红蛋白、红细胞比积、二聚体、血浆纤维蛋白等血糖相关指标,包括静脉空腹血糖、糖化血红蛋白、等尿生化指标包括小时尿量、尿蛋白、尿微量白蛋白、尿肌酐等影像学检查包括肝胆、甲状腺超及眼底镜等。计算体重指数,及肾小球滤过率。提取采用高盐法原平皓公司试剂盒提取外周血白细胞基因组,具体实验步骤如下天津医科大学硕士学位论文吸取半红细胞裂解液到一个离心管中吸取抗凝全血血液标本,加到上步装有红细胞裂解液离心管中,颠倒次,边颠倒边轻弹管壁,确保两者充分混匀,红细胞充分裂解室温放置分钟后,离心分钟,倒弃红色上清液,留下完整的管底白细胞团和大约的残留上清涡旋震荡秒,重悬,充分分散白细胞团加入细胞核裂解液到重悬的白细胞,迅速有力吹打混匀,以裂解白细胞,由于基因组立刻释放出来,混合物会马上变得十分粘稠,再颠倒或旋转离心管次,保证裂解液和所有的白细胞接触,充分裂解白细胞加入蛋白沉淀液后,在涡旋振荡器上高速连续震荡混匀秒,离心分钟小心吸取上清大约到一个新的离心管中,加入等体积的室温异丙醇,轻柔颠倒次混匀直到出现棉絮状白色沉淀乙醇后,颠倒混匀,漂洗离心分钟,弃上清。加入沉淀,离心分钟,倒去上清,然后倒置放在吸水纸上控干残留乙醇,加入溶解液,。温浴分钟,重新水化溶解沉淀用微量紫外分光光度计测和,检测所提的浓度与纯度。然后将原液标化至/,置于。保存备用。候选基因及的选择候选基因的选择本研究从影响糖尿病肾病的生物学作用出发,选择相关基因进行分析,候选基因的来源主要是,国外全基因组关联分析结果,国内外病例对照或家系研究已报道的与糖尿病肾病相关的基因,临床工作提示可能与糖尿病肾病相关的基因。糖尿病。肾病发病机制复杂,氧化应激、血流动力学改变、炎症免疫损伤、细胞因子、细胞外基质合成降解失衡、上皮细胞间质型转分化等多种因素均可影响糖尿病肾病发生。非裔美籍人型糖尿病所致终末期肾损害的全基因关联分析中证实和基因与的相关,通过磷酸化切丝蛋白、蛋白来调节肌动蛋白丝和质膜结构的重新组装,调节肌动蛋白细胞骨架,可影响足细胞屏障功能,故选取和基因作为候选基因。此外根据所查阅的相关科研艾献,选取病例对照或家系研究己报道的与糖尿病肾病相关的基因、基因。由于天津医科大学硕士学位论文通过使上皮细胞问质转分化,通过改变糖尿病肾脏血流动力学造成肾小球通过氧高压力、高滤过,通过病理性血管新生造成肾小球肥大,化应激,通过影响细胞外基质积聚等途径均可影响糖尿病肾病的发生、发展,而作为本研究候选基因。基因在许多免疫相关细胞亚群上均有表达,可调节细胞、自然杀伤细胞和淋巴组织诱导细胞的发展,而参与免疫炎症反应。基因被证实与肿瘤相关,前期研究发现其与肥胖、胰岛素抵抗相关,推测其是否与糖尿病肾病发病相关。/基因为抑癌基因,与骨髓增生异常综合征及糖尿病发病相关,糖尿病肾病病理改变与多发性骨髓瘤肾脏病变极其相似,故推测两者是否存在相同致病基因。本研究共选取个候选基因,研究与糖尿病肾病的关联性,并分析所选基因之间是否存在交互作用。选择主要依据数据库,/中每个基因的连锁不平衡状态,并根据如下原则每个候选基因的大小不同,我们以之间的连锁不平衡来确定每个基因中需要进行基因分型的数量以中国人群的基因频率勾参考,优先选择最小等位基因频率大于的对于基因编码区的错义突变、剪切位点突变和有任何已知生物学意义的突变,无论基因频率大小均列入基因分型范围。选取了个基因的个位点做单核苷酸多态性标记,对这些位点进行基因分型,来检测这些基因的单核苷酸多态性是否与糖尿病肾病发病相关,同时将检测这些基因的单核苷酸多态性是否存在基因基因之间的交互作用。本研究共检测个候选基因个位点,通过查询美国国立生物技术信息中心的遗传变异数据库/矛基因组生物信息库/,记录了它们的基本信息包括染色体定位,基因组位置和最小等位基因频率,见表。天津医科大学硕士学位论文基因分型的等位基因分型可采用寡核苷酸杂交分析和等位基因特异寡核苷酸杂交进行,大规模自动分型通常是通过微点阵芯片、基因芯片点阵、寡核苷酸点阵及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术来实现。本研究对选取的个位点的基因分型是由基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱华大基因技术平台进行的。其技术原理是首先通过扩增含有的基因组片段,然后通过序列特异性引物实现单碱基延伸,随后将制备的样品分析物与芯片基质共结晶,将该晶体放入质谱仪的真空管,而后用瞬时纳秒强激光激发。由于基质分子经辐射所吸收的能量蓄积并迅速产热,从而使基质晶体升华,核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子,产生的离子多为单电荷离子,这些单电荷离子在天津医科大学硕士学位论文加速电场中获得相同的动能,进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离,在真空小管中飞行到达检测器。由于电场中离子飞行时间与离子质量成反比,离子质量越小,就越快到达,通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量,从而检测出位点信息。该技术的主要特点是准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短,而且在每批次基因分型都设重复对照,以对基因分型结果进行监测和质量控制。经过数据质控分析,共例样本、个基因的个位点的数据均为有效数据,将其基因分型的结果录入数据库中。统计学分析采用统计软件对样本进行描述流行病学分析和数据整理。将统计软件整理的表型数据和数据库记录的基因型数据通过运用软件作关联分析。软件是一种开放的、免费的全基因组关联分析工具,其分析的基础是基因型和表型数据。通过整合和使得结果变得可视化。本实验基因型的关联分析分成二部分,均由软件包完成二分变量疾病的发病状态等的关联分析基因型交互作用。天津医科大学硕士学位论文结果临床资料简表本研究共收集了名中国北方天津地区汉族患者,分别来自天津医科大学总医院、天津医科大学代谢病医院、南开大学人民医院,其中男性例,女性例,平均年龄为士岁。糖尿病肾病患者人,非糖尿病肾病患者人,此外,糖尿病病程年,无糖尿病肾病、无糖尿病视网膜病变患者人。按是否伴发糖尿病肾病分为糖尿病肾病组和非糖尿病。肾病组,以糖尿病病程大于年,无糖尿病肾病无糖尿病视网膜病变患者作为糖尿病肾病组的对照组。一般资料及生化检测指标分布情况见表。表各项指标总的分布情况非患者组患者组病程年,非非患者组天津医科大学硕士学位论文天津医科大学硕士学位论文天津医科大学硕士学位论文肾小球滤过率计算公式应用简化方程估测,/卜木血肌酐/。水年龄女性木体重指数体重/身高天津医科大学硕士学位论文二分变量关联分析二分变量的关联分析结果中可以看到,与糖尿病肾病具有统计学意义的是基因的、位点,基因的位点,/基因的,特别是基因的位点与糖尿病肾病具有显著的相关性见表。此结果表明基因、基因及心/基因的多态性影响糖尿病肾病的发生。表糖尿病肾病的二分变量关联分析值,软件基因囊“、。一薹妻曩纛纛夏薹曩一赣簟疆一穗/糖尿病肾病以病程超过年,无糖尿病肾病无糖尿病视网膜病变的糖尿病患者为对照。天津医科大学硕士学位论文基因基因之间的交互作用糖尿病肾病是多基因遗传疾病,它的遗传易感性不仅仅与某个单一基因相关,还与多基因之问存在交互作用有关。本研究通过软件对所选个基因位点做基因交互作用分析米发现有统计学意义的基因型交互作用,有待在更多糖尿病肾病相关基因之问进行交互作用分析。天津医科大学硕士学位论文讨论糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病,糖尿病肾病是糖尿病的主要微血管病变,也是糖尿病的主要死亡原因之一。研究表明因心血管病死亡的病人数为无蛋白尿病人的倍,为一般健康人的倍。在西方国家,糖尿病。肾病是终末期肾损害的主要原因,也是肾替代疗法的主要原因,据加拿大报道,年终末期肾病病人中由引起,至年增高到美国年共有名病人进行透析和肾移植,其中病人占,该年新发生的患者为人,病人占。而在中国人群中,随着糖尿病发病率逐年升高,糖尿病肾病发病率亦增高,香港居民中肾替代疗法的患者为/万。尽管经过严格控制血糖、改善肾血流动力学、降低尿蛋白等措施治疗,糖尿病肾病一旦发生,仍很快发展成慢性肾功能衰竭、进入肾脏替代疗法,因此对糖尿病肾病发病机制的研究具有重要意义。糖尿病肾病发病机制及其复杂,多数学者认为遗传因素与环境因素的相互作用导致糖尿病肾病的发生发展,而遗传因素占重要地位。糖尿病肾病是多基因遗传模式,来自多个位点的大多数风险等位基因之间相互作用,通过数量性状的剂量效应关系,达到疾病发生的临界域值,而共同决定了糖尿病肾病的遗传易感性。国内外关于糖尿病肾病的遗传学研究显示诸多染色体位点和基因与相关,一项纳入篇探讨与人类糖尿病肾病相关基因的研究荟萃分析结果表吲个基因型与糖尿病肾病显著相关,分别为肾素血管紧张素系统相关基因基因多态性多元醇通路相关基因重复序列、等位基因,的脂代谢相关基因多态性、,附近的炎症细胞因子相关基因的与血管生成相关基因的、氧化应激相关基因型基因的、,等位基因与其他信号通路相关基因的、的、的在小样本群体分析中还发现了另外一些基因亚洲人、亚洲人、型糖尿病与糖尿病肾病显著相关。目前对于多基因遗传疾病易感基因的研究常用的策略包括候选基因法和基因组扫描法。基因组扫描是通过在基因组上每隔一定距离设立一个遗传标记常天津医科大学硕士学位论文用单核苷酸多态性标记,对遗传标记逐一分析,如果发现与某一个或某几个标记有一定程度的连锁重组,而且分数,就可推测疾病座位可能在该标记附近如果与某标记间没有重组,而个体数确切地说,应该是减数分裂事件又达到统计学要求,就可以知道该座位已非常邻近疾病座位,可以确定与疾病紧密连锁的染色体区域。再进行定点高密度标记连锁分析精细定位在前面确定的染色体易感区往往很大,需要选取高密度标记进行更精细的筛查以缩小范围,之后进行靶区域的基因组分析和编码序列的筛选,确定与疾病相关联的基因。该方法优点是可以在不知道相关基因结构和功能的情况下发现连锁的基因,且可系统、全面的筛查整个基因组,为研究未知的易感基因提供了可能然而工作量大、费用昂贵、检测力度较弱、样本人群混杂,故广泛应用受到限制。候选基因法是目前筛选易感基因最常用的方法选择编码功能异常的蛋白基因,再选择此基因或靠近此基因的一个或多个有信息的多态性位点,然后在人群或家族中应用相关或连锁研究去检测这些等位基因是否和疾病危险性相关,此方法简单易行,且针对性强、灵敏度较高。本研究采用候选基因病例对照研究法,研究天津地区型糖尿病肾病的易感基因。候选基因选择是基于以下原因糖尿病肾病肾病理以一系列超微结构改变为特征,包括基底膜增厚,。肾小球肥大,系膜增生,肾小球硬化和肾小管间质纤维化。糖尿病肾病常伴随旨小管间质纤维化,表现为肾小管基底膜增厚,细胞外基质聚集。在实验性糖尿病动物模型中发现肾脏胶原蛋白和平滑肌肌动蛋白在间质聚集明显增加,巨噬细胞在间质浸润增加【】。由于糖尿病肾病主要病理改变是肾脏纤维化,肾小管上皮细胞转分化、细胞外基质积聚、基底膜完整性破坏均可直接或间接的影响糖尿病肾病肾脏纤维化的发生。因此根据所查阅的相关科研文献和先前的研究成果,选取一些与炎症浸润、上皮细胞转分化等导致纤维化有关的基因,同时也选取了与糖尿病微血管病变、肾脏血流动力学改变存在关联或者是有广泛联系的“枢纽”基因作为本研究的候选基因。另外,还有来自已在国外报道过的与糖尿病肾病有关的易感基因,来探讨这些基因在中国人群中与糖尿病肾病的相关性。位点选择即单核苷酸多态性,根据部分基因组序列分析,两个个体之问双胞胎除外大约每一就有一个碱基差异,如果一个碱基位置发生的变异在以上的人群存在,这个位点就被定义为位点。年完成的国际计划针对欧天津医科大学硕士学位论文洲、非洲和亚洲血统的人群样本进行了基因分型,构建了全基因组图谱并确定不同种族和人群的单倍型标签和连锁不平衡特征。人类基因组中大约有多个常见的,其中大多数相邻的彼此高度相关,并且作为整体一起传递给后代的概率要大于随机分布的,称之为连锁不平衡。个的基因型能很好地预测与之相关联的邻近的基因型,一旦知道某一给定区域中的连锁不平衡组合,就可以选择出那些代表性作为标签,它们可以是一个独立的,也可以是多个的组合即单倍型。由于之间存在连锁不平衡,因此,只要对这些标签进行基因分型,就足以获得大部分未分型的遗传信息,这样就大大减少了需要分型的位点的选择策略潜在功能性位点,利用等数据库以及已发表文献中寻找目标基因,在中国人群具有较高突变频率并且可能影响基因功能的位点标签位点,利用公共数据库/删人类全基因组常见变异图谱通过标签贪婪算法来鉴定各基因的标签。鉴定出的所有位点都能被直接分型且超过基因连锁不平衡值的阈限水平。运用软件取决定系数,且,评估所有可能的对予。本研究位点的选择是基于目标基因具有较高突变频率,且可能影响基因功能的位点。共选择了个候选基因个位点进行与糖尿病肾病的关联分析。实验研究结果显示若在糖尿病肾病和非糖尿病肾病中比较,则仅发现基因的一个位点与糖尿病肾病相关联,而若以非糖尿病肾病中糖尿病病程大于、年,无糖尿病肾病无糖尿病视网膜病变患者为对照,则基因的位点,基因的位点及/基因的位点与糖尿病肾病相关联,特别是基因的位点与糖尿病肾病具有显著的关联,表明以糖尿病病程大于年,无糖尿病。肾病无糖尿病视网膜病变作为对照组结果更可靠,这是因为在所有非糖尿病肾病病例中,可能存在假阴性患者,即本身具有糖尿病肾病发病的高风险基因,尚缺乏某些激发因素未表达出来,在另一方面提示基因检测对糖尿病肾病早期诊断具有重要意义。本研究结果表明基因、基因及/基因的多态性与糖尿病肾病发病密切相关。而基因的、,基因的、,基天津医科大学硕士学位论文因的,基因的,基因的及的均未发现与糖尿病肾病相关联。本研究通过软件对所选个基因位点做基因交互作用分析未发现有统计学意义的基因型交互作用,有待在更多糖尿病肾病相关基因之间进行交互作用分析。,由个碱基对组成,至今基因,定位于号染色体,已发现个潜在外显子,末端包含两个结构域在末端存在一个蛋白激酶结构域。选择性聚集为三种异构体、】。其编码蛋白属于激酶家族成员之一,在许多组织广泛表达,在肾脏为中等程度表达【。可被和分别通过矛途径激活,激活的可使磷酸化,抑带结合降解肌动蛋白的能力,导致肌丝聚集,影响细胞骨架结构【】。与一样,均参与维持肌动蛋白细胞骨架的完整性,编码非肌肌球蛋白重链,在系膜细胞和足细胞上均有表达。非肌肌球蛋白重链在足细胞内介导肌丝的运动维持细胞结构,许多研究表明突变与糖尿病肾病相关。故推测突变在同样途径下可因细胞结构完整性破坏而使肾小球屏障功能受损引起肾脏疾病。在动物实验中发现敲除基因大鼠/一与野生型鼠相比,有中等程度的肾脏功能损害,包括集合管扩张及肾小球数目的减少【圳。在非裔美籍人型糖尿病所致终末期肾损害的全基因关联分析中己证实定位于基因区的和和一,和是的关联基因【。但在本实验中,我们未发现天津地区汉族人群中基因与糖尿病肾病相关,可能与种族差异有关。抑癌发酵引起的损伤抗逆性蛋白基因,定位于号染色体,有三种同源异构体。在酵母菌,被认为是细胞中心体的关键和保守组成部分。与酵母纺椎体组装相关,纺锤体极体的复制和复制后的解离均需要的参与。等位基因的突变不仅影向纺锤体极体半桥的形成,也影响新半桥从旧半桥的分离。研究发现是/的自然目标肽,属于钙调蛋白超家族成员,是细胞分裂和转运出细胞核的关键蛋白【】。故可通过与钙结合蛋白结合发挥其调节细胞分裂的功能,且两者的亲和力是,依赖性。全基因关联分析表明定位于基因区,与糖尿病肾损害密切相关。但在我们的实验中,未天津医科大学硕士学位论文发现基因的、与糖尿病肾病的关联性。血管紧张素转化酶,是体内血管紧张素转化形成血管紧张素的一个重要限速酶。肾素血管紧张素醛固酮系统,在高血压、心血管疾病及慢性肾的单拷贝基因,由脏疾病中均发挥重要作用。基因位于,约为个外显子和个内含子组成,第内含子碱基序列的插入和缺失多态性在人群中可以表现为型、型和型,是导致血清中水平差异的主要原因。不同基因型携带者中,其血清的水平存在差异,以型最高,型次之,型最低。血清活性直接关系到体内血管紧张素的水平。目前研究表明基因多态性与的进展有关,携带基因型的糖尿病患者,的发生率明显高于其他基因型患者【删【。对型患者研究发现仅、基因型患者的肾小球基底膜厚度增加,认为等位基因加快型肾小球病变进展【】。等报道型中型患者患终末期肾病。在不同种族中,等位基因的频率不同,报几率比其他基因型患耆高【道最高的是阿拉伯人】、索马里】、苏丹】,而在日本】及中国人】中则出现频率较低。而我们在基因的、位点未发现单核苷酸多态性与糖尿病肾病相关联。基因定位于号染色体,是进化上保守的结合蛋白家族成员之一,在许多免疫相关细胞亚群上均可表达。可调节细胞、自然杀伤细胞和淋巴组织诱导细胞的发展【。基因家族包括四个基因分别是,一,。主要表达于胸腺调节细胞的分化【】。在人类的功能尚未完全明了,但小鼠基因与结构域同源性为,主要功能是影响下丘脑垂体性腺轴【。是神经元存活因子,在神经元高效表达并调节钙依赖性转录【。的确切结构及功能尚未完全清楚,但这种蛋白已经被证实能识别加合物尤其是铂类抗癌药物产生的,这意味着可能参与损伤应答和修复途径】。在肺癌和乳腺癌研究中,发现启动子区存在甲基化,基因甲基化后使基因出现表