硕士论文-玄芪平消汤防治早期糖尿病肾病的实验研究

河北医科大学硕士学位论文玄芪平消汤防治早期糖尿病肾病的实验研究姓名李晓蕾申请学位级别硕士专业中医内科学指导教师张庚良20090301中文摘要肾阴亏虚是下消的主要病机。玄芪平消汤功能益气养阴、清热活血，标本兼治。本方已应用多年，疗效甚佳，可见应用玄芪平消汤防治早期是有一定理论和临床实践基础的。本实验采用腹腔注射链脲佐菌素（）的方法复制大鼠模型，观察玄芪平消汤对血糖、血脂、肾功能、小时尿白蛋白排泄率、肾脏病理形态学、肾重体重的值、血浆及肾组织中血管紧张素（）含量、以及肾组织中基质金属蛋白酶（、）表达的改变。初步探讨本方防治早期的作用机理，为益气养阴、清热活血法防治早期提供科学的实验依据。方法选用健康大鼠（雄性，体重士）只，普通饲料喂养周，检测血糖、尿糖均为阴性，按体重随机分为正常组（只）、模型组（只）、玄芪平消汤组（只）、苯那普利组（只），除正常组外，其他三组均采取腹腔注射链脲佐菌素（）复制糖尿病模型，造模小时后测血糖超过，即确定为糖尿病模型大鼠。正常组注射相当体积的柠檬酸缓冲液。造模第三天，模型组、苯那普利组、玄芪平消汤组，分别给予自来水、苯那普利、玄芪平消汤灌胃，每日一次。正常组也给予相同体积的自来水灌胃。实验期间，各组动物自由进食、饮水。于第周用代谢笼收集小时尿液，用放射免疫法测定尿微量白蛋白，计算尿白蛋白排泄率（，），并测尿肌酐（，）。于第周末，禁食小时，称重，全部动物被处死股动脉取血，分离血清，用全自动生化分析仪检测各组大鼠血糖（）、总胆固醇（）、甘油三酯（）、尿素氮（）、血肌酐（），计算中文摘要内生肌酐清除率（）。无菌操作取双肾，剥离被膜后双肾称重，计算肾脏肥大指数（，），左肾固定后石蜡包埋，切成厚的切片行和染色。光镜下观察肾脏病理形态学变化。右肾于矢状面纵向切开后，取部分右肾组织匀浆后离心，取上清备测肾组织含量。右肾余组织置甲醛初步固定，常规固定，石蜡包埋切片备用，待用免疫组化法检测在肾组织的表达情况，并用病理图像分析软件进行半定量分析。统计学处理，所有数据均用士表示，采用单因素方差分析法，数据统计应用统计软件完成。结果（）一般情况及血糖造模后糖尿病各组大鼠体重增长缓慢，毛色差，血糖增高，与正常组比较有显著性差异（），玄芪平消汤组有一定的降糖作用，与模型组比较有显著性差异（），苯那普利组无明显降糖效果，与模型组比较无显著性差异（）。（）血脂第周末，除正常组外，其余各组未出现血脂明显增高，与正常组比较均无显著性差异（），玄芪平消汤组不能降低和的水平，与模型组比较无显著性差异（），苯那普利组降脂效果亦不明显，与模型组比较无显著性差异（），两组间比较无显著性差异（）。（）肾功能模型组、与正常组比较无显著性差异（），苯那普利组和玄芪平消汤组均不能降低、的水平，与模型组比较无显著性差异（），两组间比较无显著性差异（）。中文摘要（）尿白蛋白排泄率第周末，模型组尿白蛋白排泄率明显高于正常组（），玄芪平消汤组和苯那普利组均能降低尿白蛋白排泄率，与模型组比较有显著性差异（），但两组比较无显著性差异（）。（）肾重体重的比值模型组肾重体重的比值明显高于正常组（），玄芪平消汤组与苯那普利组肾重体重的比值明显低于模型组，与模型组比较有显著性差异（。），两者之间无显著性差异（）。（）血浆及肾组织中含量模型组中血浆及肾组织中含量均高于正常组（）。苯那普利组血浆及肾组织中含量明显低于模型组（），玄芪平消汤组肾组织中含量明显低于模型组（）而血浆中含量低于模型组（），两者之间无显著性差异（）。（）肾组织病理形态学观察模型组光镜下可见肾小球体积增大，球囊增大呈分叶状，肾小球毛细血管基底膜增厚，系膜细胞增生，系膜区增宽，系膜基质染色呈强阳性，肾小管上皮细胞肿胀变性。玄芪平消汤组及苯那普利组大鼠肾组织病变如肾小球基底膜增厚及系膜细胞增生比模型组有明显改善，系膜区染色阳性物质明显减少。（）肾组织中免疫组化结果糖尿病组与对照组相比，肾组织表达明显降低而血浆及肾组织中含量升高（），玄芪平消汤组和苯那普利组的表达与模型组比较明显增加，有统计学意义（），玄芪平消汤组和苯那普利组比较无统计学意义（）。半定量分析结果显示模型组每张切片中阳性染色面积占视野中文摘要中肾小球总面积的比值明显低于正常组（），提示玄芪平消汤组和苯那普利组都可增加糖尿病大鼠肾小球、。肾小管及肾间质中的表达，并且玄芪平消汤组和苯那普利组比较无明显差异（）。结论玄芪平消汤能够改善实验性糖尿病大鼠一般状态，降低糖尿病大鼠血糖，减少尿蛋白的排出，保护肾脏。抑制早期肾脏肥大及高滤过，改善肾脏形态结构的同时还可以增加在肾组织的表达而降低血管紧张素水平，一定程度上可以改善糖尿病的肾损害，延缓肾脏纤维化进程。玄芪平消汤对糖尿病大鼠模型的干预作用与苯那普利基本相同，在降糖方面优于苯那普利。关键词糖尿病肾病；玄芪平消汤；苯那普利；肾素一血管张素系统；基质金属蛋白酶一；实验研究英文摘要（），。，。（）（）一，（）（，）英文摘要，（），、，。，（），一，（），（一）荚文摘要一一，（，士），（），（），（），（）门，（）芝，一，（。，），（，），（），（），（），（），（，），一一英文摘要（，），（，），土，（），（），（），（）（），一英文摘要，（），（），（），（）（），（），（），（）（），（），（）（），（），。，（），（）（）（）（），（、）（、），（）（），。（），（），（），（）。（），（），。，。；河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师（或指导小组）的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。肿喵，譬峁哆、。一。一研究生签名巷螭导师签章私擦詹级学院领导签章；菱。一。，。一年月日河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生躲鸯麟聊擗垮月目研究论文玄芪平消汤防治早期糖尿病肾病的实验研究刖舌糖尿病（，）是一种多病因的代谢疾病，其特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素（）分泌及（或）作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱，造成多种器官的慢性损害、功能障碍和衰竭。其患病率正随着人们生活水平的提高，人口老化，生活方式的改变而迅速增加。糖尿病肾病（，）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是型糖尿病患者的首位死亡原因，在型糖尿病患者，其严重性仅次于冠状动脉和脑血管动脉粥样硬化病变。糖尿病肾病（，）又称糖尿病肾小球硬化症，是糖尿病（，）常见的慢性微血管并发症之一。糖尿病病程在，年，的发生率为，出现临床蛋白尿的患者约年内有进入终末期肾病（，）近些年来，已经取代慢性肾小球肾炎或高血压肾病而成为导致的主要病因，的发病呈迅速上升趋势，严重危害人民的健康。研究发现，一旦发生，若蛋白尿控制不良，肾损害发展速度较快，且目前尚缺乏有效治疗手段，绝大多数患者在较短时间内进入终末期尿毒症，此阶段患者平均存活约年，而终末期尿毒症患者必需接受肾脏替代治疗透析或肾脏移植），为此全球都在关注的治疗问题，特别是早期治疗。的发病是复杂的，多因素性的，这些因素可能包括血糖控制不佳、生化改变、遗传因素、摄入过量蛋白质、高研究论文血压、生长激素和高血糖分泌过多、脂肪代谢异常、肾脏血流动力学异常、结构异常及吸烟等。其确切机理尚未全部阐明，目前已形成以下几方面主要学说（）多元醇通路学说。（）氧化应激学说。（）非酶促蛋白糖基化学说。（）肾素血管紧张素系统（）激活学说。（）内皮素生成异常学说等。的主要病理特点是系膜区系膜细胞增生、大量基质堆积，系膜区变宽或结节形成以及肾小管、肾小球基底膜增厚，继而发展为肾小球硬化，最后发展为肾功能衰竭。糖尿病属于中医学消渴病范畴，病机特点为燥热阴虚，病程曰久，阴津耗伤不止，同时耗气，进而导致气阴两虚。中医虽无之名，但从症状来看，当属其变证之一，多为消渴病日久病情发展而致。早期的病机特点是以气阴两虚为主。导师根据多年临床经验，总结出玄芪平消汤，疗效显著，可见应用玄芪平消汤防治早期糖尿病肾病是有一定理论和临床实践基础的。材料与方法实验材料实验动物选用健康雄性大鼠只，体重，鼠龄周。由河北省动物实验中心提供（合格证号）。实验药物及试剂（）受试药物玄芪平消汤（黄芪玄参生地麦冬黄连知母山萸肉白术川芎旱莲草地骨皮葛根牡丹皮），常规水煎，浓缩研究论文成含生药。（）西药对照组盐酸苯那普利片，规格，北京诺华制药有限公司生产。用蒸馏水配制成浓度为的悬浊、液。（）造模用试剂链脲佐菌素（，），美国公司生产。（）生物素标记的山羊抗兔（）多克隆抗体，北京中山生物科技有限公司提供。（）尿糖试纸桂林中辉生物技术有限公司（）白蛋白放射免疫测定药盒（中国原子能科学研究院同位素研究所）（）抗体稀释液（北京中山生物技术有限公司）（）显色试剂盒（福州新生物技术开发公司）（）两步法免疫组化试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司提供。（）血浆及肾组织放射免疫试剂盒（北京北方生物技术研究所提供）（）考马斯亮兰蛋白测定试剂盒（南京建成生物公司）实验仪器自动血糖分析仪及配套试纸美国强生公司自动生化分析仪美国高速低温离心机德国贺利氏公司型石蜡切片机德国公司型电热恒温鼓风干燥箱上海仪恒科技有限公司型电热式蒸汽消毒器山东新华医疗器械厂研究论文高速冷冻离心机医用离心机厂光学显微镜日本型超薄切片机德国公司脱水机英国姗顿公司，包埋机英国姗顿公司烤片机湖北孝亚光电子技术研究所一微波仪浙江临安电子仪器厂超低温冰箱德国贺利氏公司实验方法模型制备实验动物购买后，普通饲料适应性喂养周，检测血糖、尿糖均为阴性，按体重随机分为正常组（）只、模型组（）只、玄芪平消汤组（）只，苯那普利组（）只，实验期间，各组动物自由进食、饮水。大鼠适应性喂养一周后，禁食小时，除正常组外，其他三组大鼠用枸橼酸缓冲液（，。）临用前配成溶液，按瓜采取腹腔注射复制糖尿病模型，造模小时后分别取上述各组大鼠尾尖血测血糖，每日一次，连续三日，空腹血糖，即确定为糖尿病模型大鼠。正常对照组注射相当体积的柠檬酸缓冲液。动物各组给药情况正常组于模型组和治疗组造模后第三天，每日灌服与给药组所灌服中药相当体积的蒸馏水，直至第周末。模型组于造模后第三天开始每日灌服与给药组所灌服中药相当体积的蒸馏水，直至第周末。研究论文苯那普利组于造模后第三天开始灌胃给药（剂量为），每日一次，直至第周末。玄芪平消汤组于造模后第三天开始灌胃给药（生药），每日一次，直至第周末。标本留取实验共周，各组大鼠于周末，用代谢笼留取小时尿，计算尿量（），放置冰箱保存，待测尿白蛋白排泄率（，）、尿肌酐（，），在水合氯醛（）麻醉下，股动脉取血，自然凝聚后离心分离血清，用于血糖、生化指标及血浆含量测定，大鼠处死后，无菌操作取双肾，剥离被膜后双肾称重，计算肾脏肥大指数（，），左肾固定后石蜡包埋，切成厚的切片行和染色。光镜下观察肾脏病理形态学变化。右肾于矢状面纵向切开后，取部分右肾组织匀浆后离心，取上清备测肾组织含量。右肾余组织置甲醛初步固定，常规固定，石蜡包埋切片备用，待用免疫组化法检测在肾组织的表达情况，并用病理图像分析软件进行半定量分析。观察指标和方法一般状态观察包括精神状态、毛色、饮食量、尿量、体重等。一总胆固醇（）、甘油三酯（）、尿素氮（）、血肌酐（），采用全自动生化分析仪检测，并计算内生肌酐清除率（），（）尿肌酐浓度宰每分钟尿量血浆肌酐浓度。尿微量白蛋白采用放射免疫法测定，尿微量白蛋白排研究论文泄率（）尿白蛋白含量（）木尿量（）。光镜下观察肾组织病理形态学变化染色的步骤石蜡切片脱蜡至蒸馏水一苏木素核染盐酸分化（快浸一下）水冲一伊红左右一水洗一下一梯度酒精脱水一二甲苯透明一封片。染色步骤石蜡切片脱蜡至水一高碘钾一直接蒸馏水洗两次至多次液浸泡（显微镜下控制时间）一流水冲洗一苏木素染核一梯度酒精脱水一二甲苯透明一树胶封固。的测定大鼠腹腔麻醉后，股动脉取血，置于装有抗凝（、二巯基丙醇、羟基喹啉）的试管中，混匀后。，离心，分离血浆，。保存备测血的含量。右肾取约加乙酸，煮沸，冷却后在冰箱中匀浆，。，离心。取上清置。保存备测肾组织含量，采用放射免疫法，具体步骤严格按照试剂盒说明书操作并用考马斯亮兰蛋白法测定组织匀浆中蛋白含量，肾组织结果用每肾组织中含量表示。肾组织中免疫组化检测右肾余组织用多聚甲醛固定小时后，依次用渐高梯度的乙醇脱水，二甲苯透明，。浸腊后石蜡包埋。载玻片经明矾溶液（明矾，硫酸铬钾，双蒸水定研究论文容至）处理，制作岬厚石蜡切片，。烤片，常温保存备用。免疫组化步骤为（）石蜡切片常规脱蜡至水（二甲苯木；无水乙醇；乙醇；乙醇；乙醇串乙醇串）。（）双蒸水新鲜配，避光室温以灭活内源性过氧化物酶。双蒸水洗次，浸洗。（）抗原修复将切片浸入稀释后的抗原修复液（双蒸水为）中，微波炉加热，。和。各分钟，中间间隔分钟，然后室温下冷却分钟以上（在冷却过程中切勿将切片自液体中取出），双蒸水冲洗后浸洗分钟宰次。（）清封闭滴加正常兔血清封闭液（），室温分钟，顷去勿洗。（）第一抗体滴加适当比例稀释（）的第一抗体混匀，置湿盒中。孵育过夜（小时左右），浸洗分钟木次。（）第二抗体滴加生物素标记的山羊抗兔（），混匀，。孵育分钟，浸洗分钟木次。（）滴加链酶卵白素标记辣根过氧化物酶试剂滴，混匀，。孵育分钟，浸洗分钟木次。（）显色滴加。显色液（预先分钟配制），显微镜下控制染色时间，常温下显色分钟，自来水浸洗终止反应。研究论文（）核染苏木素复染分钟，盐酸酒精分化秒，氨水返蓝秒，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。一实验同时以代替一抗作为阴性对照。图像分析采用型全自动彩色病理图像分析，放大倍连续选取不重复的个视野分析每张切片中阳性染色面积占视野中肾小球总面积的比例。取平均值作半定量分析。统计学处理使用统计软件，所有数据均用均数标准差（士）表示，采用单因素方差分析法对实验结果进行统计学分析。结果大鼠一般情况在整个实验过程中，正常对照组无糖尿病症状，血糖在之间，大鼠精神状态佳，体重明显增加，皮毛有光泽，与正常对照组比较，模型组大鼠明显消瘦，早期多动、敏感、好打斗，后期迟纯、精神萎靡、皮毛无光泽疏松、小便量多，体重减轻，进食量、饮水量明显增加。其中只大鼠因血糖过高、感染等原因而死亡，未纳入最后统计。最终完成实验的大鼠数量分别为正常对照（）只、糖尿病对照组（）只、苯那普利阳性对照组（组）只、玄芪平消汤组（）只。各组大鼠血糖水平比较，见表造模后糖尿病各组大鼠血糖增高，与正常组比较有显著性差异（），玄芪平消汤组有一定的降糖作用，与模型研究论文组比较有显著性差异（），苯那普利组无明显降糖效果，与模型组比较无显著性差异（）。（见附图）各组大鼠肾重体重比值的比较，见表模型组肾重体重的比值明显高于正常组（），玄芪平消汤组与苯那普利组肾重体重的比值明显低于模型组，与模型组比较有显著性差异（），两者之间无显著性差异（）。（见附图）各组大鼠血脂水平比较，见表第周末，除正常组外，其余各组未出现血脂明显增高，与正常组比较均无显著性差异（），玄芪平消汤组不能降低和的水平，与模型组比较无显著性差异（），苯那普利组降脂效果亦不明显，与模型组比较无显著性差异（），两组间比较无显著性差异（）。（见附图）各组大鼠肾功能比较，见表模型组、与正常组比较无显著性差异（），苯那普利组和玄芪平消汤组均不能降低、的水平，与模型组比较无显著性差异（），两组间比较无显著性差异（）。（见附图、）各组大鼠血浆及肾组织中含量的比较，见表模型组中血浆及肾组织中含量均高于正常组（）。苯那普利组血浆及肾组织中含量明显低于模型组（，），玄芪平消汤组肾组织中含量明显低于模型组）而血浆中含量低于模型组（），两者之间无显著性差异（）。（见附图、）各组大鼠尿蛋白排泄率比较，见表第周末，模型组尿白蛋白排泄率明显高于正常组研究论文（），玄芪平消汤组和苯那普利组均能降低尿白蛋白排泄率，与模型组比较有显著性差异（），但两组比较无显著性差异（）。（见附图）肾组织病理形态学观察染色肾脏结构清楚，细胞核呈蓝色，胞浆呈粉红色，与正常对照组相比，糖尿病组周时可见肾小球内系膜区增宽，细胞核数目增加。染色可见肾小球系膜轻度增生、肾小管轻度颗粒样变，基底膜轻度增厚、僵硬，但未见肾小球结节样增生和动脉玻璃样变等典型的糖尿病肾病改变，系膜基质染色呈强阳性，肾小管上皮细胞肿胀变性（见附图、）。玄芪平消汤组及苯那普利组大鼠肾组织病变如肾小球基底膜增厚、肾小管颗粒样变及系膜细胞增生比模型组有明显改善，系膜区染色阳性物质明显减少。（见附图、）肾组织中免疫组化结果抗原免疫组化染色示棕黄色或深棕黄色，其主要表达在大鼠肾小球系膜细胞、内皮细胞、包曼氏囊壁层上皮细胞、肾小管上皮细胞，偶见浸润的巨噬细胞和中性粒细胞表达。本实验表明糖尿病组与对照组相比，肾组织表达明显降低而血浆及肾组织中含量升高（），玄芪平消汤组和苯那普利组的表达与模型组比较明显增加，（见附图、）有统计学意义（），玄芪平消汤组和苯那普利组比较无统计学意义（）。半