[硕士论文精品]医院常见致病菌耐药谱及耐药菌同源性分析

兰州大学硕士学位论文医院常见致病菌耐药谱及耐药菌同源性分析摘要目的了解医院常见耐药菌分布状况，追踪由质粒介导的耐药菌在医院病区传播途径及其耐药谱，探讨细菌耐药性的传播机制及不同来源耐药菌的同源性，为预防和控制院内感染提供依据。方法以兰州市两所医院的五个不同科室为采样点，分别采取病人床单、医护人员手、空气等标本，采用细菌常规鉴定方法进行致病菌的鉴定，从医院病房采集标本中筛选金黄色葡萄球菌及大肠杆菌，并借助药敏实验、质粒消除及转化实验、质粒图谱、限制性内切酶图谱等技术对两种菌进行耐药性及质粒同源性分析。结果从两家省级医院五个科室共采集196份标本，分离病原菌380株，其中革兰氏阳性菌195株，占513，革兰氏阴性菌185株，占487，其中大肠杆菌25株，金葡菌15株，分离率分别为128、77。药敏结果显示，病房分离的25株大肠杆菌对所用的8种抗生索耐药，耐药率达760，280的菌株对一种抗生素耐药，320的菌株对三种及三种以上抗生素耐药。临床分离菌株中，除1株对两种抗生素具有耐药性以外，其余菌株对三种及三种以上抗生素具有耐药性，其多重耐药率达917。15株金葡菌中867的菌株对除头孢西丁、头孢唑啉、头孢三嗪、万古霉素外的其它7种抗生素呈不同程度的耐药，耐药率达67600，耐药率最高的为青霉素，最低的为庆大霉素，467的菌株对三种及三种以上抗生素耐药，只有2株菌对一种抗生素耐药。在25株大肠杆菌中19株检出质粒，检出率为760，所有菌株均携带248KB大小的质粒，提示该质粒是医院致病性大肠杆菌的流行质粒。12株临床分离大肠杆菌均携带质粒，共检出60个质粒，较病房分离株所携带的质粒大，大部分在10OKB之上，833的菌株含有五种及五种以上质粒。本次分离的15株金葡菌中12株含有质粒，其携带率为667，检出质粒的菌株均带有约38KB大质粒，最多的L株菌带有11种质粒。对13株携带耐药质粒的大肠杆菌病房分离株进行质粒消除，除1株菌的耐药性始终未发生变化外，其余12株的耐药性有不同程度地改变，其中7株耐药性全部消失，5株仅有部分改变；12株临床分离株经质粒消除后，除2株菌的酬药性始终未变外，其余10株耐药谱发生显著变化。对11株含有耐药质粒的金葡菌进行质粒消除后发现，除2株菌的酬HTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文药性始终未发生变化外，其余9株其耐药谱有显著变化，其中3株菌耐药性全部消失，而其余6株仅有部分耐药性发生改变。对大小相同的大肠杆菌耐药质粒经ECORI酶切后发现，同一科室大肠杆菌携带的耐药质粒含有相同DNA片段，不同科室菌株酶切图谱也相似，表明相同科室及不同科室均有同源性大肠杆菌存在。对同一医院相同科室的4株耐药金葡菌酶切后发现，3株菌均切到215KB片段，且其中2株同时切出77KB、153KB、215KB三个大小相同的DNA片段，表明相同医院同一科室有同源性金葡菌存在。结论从金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的科室分布特点可知，医院病房存在医护人员一医疗器械一病人一物表一陪护人员间的交叉感染，各病房耐药菌株通过耐药质粒的传递，从而造成同源性耐药菌在各科室的传播流行。因此，医院应及时采取相应措施，以有效控制，耐药菌在医院的播散，防止院内感染暴发流行。关键词金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，医院感染，耐药质粒，同源性，药敏实验质粒图谱IIHTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文RESEARCHONBOTHANTIBIOGRAMANDHOMOLOGYOFTHEANTIBIOTICRESISTANCEOFSTAPHLOCOCCUSAUREUSANDESCHERICHIACONINHOSPITALABSTRACT0协ECTIVETOUNDERSTANDTHEDISTRIBUTIONANDTHEEPIDEMICCONDITIONOFANTIBIOTICRESISTANTBACTERIAINHOSPITAL，TOTRACEABOUTSPREADINGWAYSLEADEDBYPLASMIDSINHOSPITALCARES，ANDTODISCUSSTHEHOMOLOGYOFRESISTANTBACTERIAANDTHEINFECTIONAPPROACHOFDIFFERENTRESISTANTPATHOGENSOTHATCALLPROVIDEEVIDENCEFORTHECONTROLOFNOSOCOMIALINFECTIONMETHODSSPECIMENSWERECOLLECTEDFROMDOCTORSANDNURSESHANDS，PATIENTSHEETSANDAIROFFIVESECTIONOFFICESOFTWODIFFERENTLEVELHOSPITALSINLANZHOUTHEECOLIANDSTAUREUSSTRAINSWEREIDENTIFIEDBYNORMALSTANDARDMETHODSTHEANTIBIOTICSENSITIVITYTEST，PLASMIDELIMINATIONANDTRANSDUCTION，PLASMIDPROFILESANDRESTRICTIONENDONUCLEASEPROFILESWEREUSEDINANALYZINGBOTHTHEHOMOLOGYOFTHEIRRESISTANTPLASMIDSANDANTIBIOTICRESISTANTRESULTS380PATHOGENSSTRAINSWEREISOLATEDINWHICHGRAMNEGATIVEBACTERIAWASL95STRAINS513ANDGRAMPOSITIVEBACTERIAWERE185STRAINS487BOTH25ECOLI128STRAINSAND15STAUREUS77STRAINSWEREISOLATEDATTHESAMETIME，12ECOLISTRAINSWERECOLLECTEDFROMHOSPITALPATIENTSANTIBIOTICSENSITIVITYTESTHADSHOWNTHAT25STRAINS760FROMCAREENVIRONMENTWERERESISTANTTOTHEEIGHTCOMMONANTIBIOTICSINDIFFERENTDEGREERESISTANTSTRAINSTOONEANTIBIOTICSWEREONLY28OANDMULTIRESISTANTSTRAINSWEREACCOUNTEDFOR32OBUTTHERESTRAINSFROMPATIENTSWERESERIOUSLYRESISTANTTOANTIBIOTICSANDTHEONLYONESTRAINWASJUSTRESISTANTTOTWOANTIBIOTICS，THEMULTIRESISTANTRATESWERE917867STAUREUSSTRAINS13151WERERESISTANTTOTHESEVENANTIBIOTICSINDIFFERENTDEGREESEXCEPTFORCEFLRIAXONE，CEFOXITIN，PIPERACILLINANDVANCOMYCIN，WHICHRESISTANTRATESWEREFROM67TO600THERESISTANTRATETOPENCICILINWASTHEHIGHESTANDTHERESISTANTRATETOGENTAMICINWASTHELOWEST467STRAINSWERERESISTANTTOTHREEANDMOREKINDSOFANTIBIOTICS，ONLY2STRAINSWEREJUSTRESISTANTTOONEANTIBIOTICSTHEREWERE19CARELLLHTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文ENVIRONMENTECOLISTRAINSCARRIEDPLASMIDS760AMONGTHEM，12STRAINSCARRIEDRESISTANTPLASMIDANDTHE248KBPLASMIDWASTHEPOPULARONEBUTALLOF12STRAINSISOLATEDFROMPATIENTSCONTAIN60PLASMIDSWHICHWEREALLABOVE10KB833ISOLATESCARRIEDFIVEANDMOREPLASMIDS12STAUREUSSTRAINSCARRIEDPLASMIDSWEREISOLATEDFROM15667THE38KBPLASMIDWASCONTAINEDINEVERYSTRAINS，ONESTRAINEVENCARRIED11PLASMIDSTHESERESULTSOFPLASMIDELIMINATIONSHOWEDTHATTHERESISTANCEOFECOLIISOLATESFROMCAREENVIRONMENTWERECHANGED，EXCEPTOFONESTRAINPOSSESSEDRESISTANCECONSISTENTLY，THEOTHERTWELVEONESWERECHANGEDINDIFFERENTDEGREES，INWHICHSEVENSTRAINSWEREEXCHANGEDINTOBEINGSENSITIVE，BUTFIVEISOLATESSTILLPOSSESSEDPARTANTIBIOTICSRESISTANCEAFTERTHEPLASMIDSOFTHETWELVECLINICALECOLISTRAINSWEREELIMINATED，THEREWASGREATCHANGEINNINESTRAINS，WHILETHREESTRAINSPOSSESSEDRESISTANCECONSISTENTLYTHEELEVENSTAUREUSWITHRESISTANCEPLASMIDSSHOWEDTHATTHERESISTANCEOFTWOSTRAINSWASNOTCHANGEDALLTHETIME，THREESTRAINSBECAMESENSITIVE，ANDTHEOTHERSIXSTILLRETAINEDPARTOFRESISTANCETHEENDONUCLEASEPROFILESREVEALEDTHATTHEECOLISTRAINSFROMSAMECAREHADINPARTOFHOMOLOGY，THEREWERESIMILARENDONUCLEASEPROFILESAMONGDIFFERENTWARDSSTRAINSFOURSTAUREUSISOLATES，WHICHWEREINTHESAMEWARDANDCARDEDRESISTANCEPLASMIDS，WEREDIGESTEDBYENZYMEECORI，WHICHRESULTWASTHATTHREESTRAINSCONTAINED215KBPLASMID，ANDTWOOFTHEMWERECUTINTO77KB，153KBAND215KBFRAGMENTSTHERESULTSSHOWETTTHATTHEREWEREHOMOLOGOUSSTAUREUSSTRAINSINTHESAMEWARDSCONCLUSIONSTHEREWASCROSSINFECTIONAMONGPATIENTS，NURSES，DOCTORSANDMEDICALAPPARATUSES，ETCDIFFERENTWARDSHADTHEIRSPECIALPOPULARPLASMIDS，SOMEOFTHEMHADCERTAINHOMOLOGYANDCOULDBETRANSFERREDBYANTIBIOTICISRESISTANTPLASMIDSAMONGDIFFERENTSTRAINSOF，BACTERIASOSOMEMEASURESSHOULDBETAKENTIMELYTOCONTROLTHETRANSMISSIONOFRESISTANTSTRAINSEXTENSIVELYINHOSPITALCARESKEYWORDSSTAPHYLOCOCCUSAUREUS；ESCHERICHIACOLI；NOSOCOMIALINFECTION；RESISTANTPLASMID；HOMOLOGY；ANTIBIOTICSENSITIVITYTEST；PLASMIDPROFILESHTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院原创性声明本人郑重声明本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名丕盔舀圭垒日期丝I笪垄HTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院关于学位论文使用授权的声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名丕舀圭丝导师签名日期锄。F印、K蹲HTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文日U舌自1929年FLEMING发现青霉素以来，大量抗菌药物研制成功并广泛应用，为治疗人类和动物细菌性传染病作出巨大贡献，使得许多疾病得到了控制和彻底治疗。但是，随着抗生素在全球的广泛使用，也导致了曰益严重的细菌耐药性问题，特别是多重耐药现象使得耐药性同趋复杂化，并且有蔓延扩散趋势【1】，给临床的有效治疗带来极大困难。大量研究证明，新型抗菌素的开发研究远远落后于细菌耐药性的发展速度，且目前临床上抗生素的应用还主要是无药敏实验指导的经验性用药，这无疑加重了细菌耐药性的产生。另外，由于目前我国经济水平比较落后，对医院投入不足，医疗机构普遍实行以药养医的补偿机制，从而导致严重的抗生素滥用现象。再加上我国医药供给一需求环节严重脱节，社会人群自主使用抗生素现象普遍，进而加剧了抗生素的不合理应用，导致细菌耐药性快速增长。目前严重的细菌耐药性问题是个全球性的问题，2002年国家细菌耐药性监测网对北京、天津、广东等8个省、市、自治区的57家三级甲等医院的临床常见细菌的检出率及耐药性进行了监测，其监测结果21表明大肠埃希菌、绿脓假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是最常见的院内感染菌，且各种菌对常见抗生素的耐药情况不同。其中大肠埃希菌对氨苄西林、庆大霉素及环丙沙星等的耐药率均高于500，对亚胺培南的耐药率仅为03。金葡菌对青霉素的耐药率达945，对红霉素的耐药率超过700，末发现耐万古霉素菌株。另外，苗佳等嘲对成都市三所三甲医院临床分离致病菌的菌群分布及其对常用抗菌药物的耐药状况分析表明革兰氏阳性菌占2496，革兰氏阴性菌占7504。其中最常见的革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌，最常见的革兰氏阴性菌依次为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍氏不动杆菌等。其中金黄色葡萄球菌对青霉素、红霉素和克林霉素总的耐药率分别高达891、657和425，但对头孢菌素类和喹诺酮类抗生素的耐药率均在30以内。大肠埃希氏菌对头孢菌素普遍敏感，但对氟喹诺酮类药物、哌拉西林和庆大霉素的耐药率均接近50。因而广大医务工作者应高度重视严重的细菌耐药现象。细菌对抗生素的耐药机制主要包括遗传学机制和生化机制45遗传学机制包括细菌先天固有耐药和染色体突变或获得新的脱氧核糖核酸分子；生化机制是指细菌获得性耐药或质粒介导的耐药。其中生化耐药机制主要有4类1细菌产生灭活酶或钝化酶，破HTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文坏或修饰抗生素的活性结构；2抗生素作用的靶位改变，抗生素不能与其结合或结合力降低；3引起细菌细胞膜通透障碍，抗生素不易进入或无法进入细胞内达到抗生素作用的靶位；4泵出系统功能增强，抗生紊在菌体内达不到有效浓度。此外，尚有细菌细胞膜主动转运减少和建立新的代谢途径等。总之，细菌耐药的遗传机制和生化机制非常复杂，表型多种多样，同种耐药机制可存在于不同的耐药菌株中，不同的机制可同时存在于同一菌株内协同发挥作用。但细菌耐药的根本内因是遗传物质的改变，主要外因是抗生素的诱导，而耐药质粒的产生和传播则是细菌扩散耐药性及新的菌株获得抗药性的一种快捷方式。质粒是染色体外具有遗传功能的双链DNA，广泛存在于草兰氏阳性和阴性菌中，几乎所有致病菌皆有之16】，并可通过菌株间的接合进行传递。耐药质粒传递产生的耐药现象在自然界发生的细菌耐药现象中占有重要地位，也最为常见。李倩等【71报道，从烧伤病房、医护人员及病房环境表面采集的34株葡萄球菌，质粒消除后有32株抗性消失，由质粒介导的耐药基因占77，由染色体编码的耐药基因占23，此结果进一步说明由质粒介导的耐药性比例较大。另外，染色体编码的耐药基因主要将抗药性垂直传给子代，通过转座子水平传播的几率很小，而质粒介导的耐药性既能垂直传播又能通过转导、转化在不同菌株间进行水平传播嗍，是近年医学界所面临的重大难题。在耐药菌的同源性研究中，以往常用的生化反应、血清学特点、代谢产物分析、耐药谱特征及简单的调查方法等，目前已无法深入了解并难以得到满意的结果。而质粒图谱分析作为一种特异、经济、快速、重复性强的细菌学鉴定方法，可以识别流行株与非流行株感染、明确耐药基因定位等，近年来得到迅速发展。自美国CDC1981年将质粒指纹图谱分析用于细菌流行病学调查以来，发现它的特异性与噬菌体分型相当，并远优于药敏实验，血清学和生化分型【1叭。但因并非所有菌株都有相应的标准分子量质粒株作参考，所以每株菌是否均可提取到细菌中存在的所有质粒，常常不能肯定，而只能借助于以往有关文献报道作一大致判断。另外，由于质粒具有可转移性，细菌在多次传代或保存中可能发生质粒丢失等，这些均使质粒图谱分析的广泛应用受到限制。限制性内切酶分析目前却已成为鉴定质粒DNA是否同源的可靠技术。金葡菌和大肠杆菌是医院和社区获得性感染的主要病原菌，其主要危害在于由质粒介导的多重耐药性，且带有多重耐药基因的酬药质粒可通过在不同细菌问广泛传播引起院内感染不断发生，给患者的治疗及医生用药造成了诸多困难口】。金黄色葡萄球菌在新生儿科、烧伤科等病房可引起各种感染如败M症、肺炎、伤口感染和骨髓炎等不断发生。HTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文大肠杆菌是临床上最常见的条件致病菌，虽然诸多抗生素对其引起的医院感染有效，但一旦形成同病区的抗药性非暴发流行株，很可能成为长期潜伏在医院内并随时引发感染的危险病菌。以往研究阱31也表明这两种苗在院内感染常见菌中分别位于革兰氏阳性和阴性菌的首位。据此本实验选取金葡菌和大肠杆菌进行研究，从兰州市两家省级医院的烧伤科，新生儿科，LCU病房、普外科共五个科室的医护人员手及病房环境表面等处采样，进行细菌培养及分离鉴定，以了解常见耐药菌的医院分布状况。并对其中的15株金葡菌和25株大肠杆菌及同期从医院检验科收集到的12株大肠杆菌的药敏谱、质粒消除情况、质粒图谱及限制性内切酶图谱等进行深入研究，以了解其医院分布状况、耐药机制、同源性关系及质粒介导的耐药性的播散途径等，从而为临床合理选用抗生素，有效防治细菌性疾病，特别是由质粒介导的多重耐药菌引起的各种院内感染性疾病提供基础资料。HTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文第一部分医院环境中常见致病菌检测状况月U舌随着抗生素的广泛使用，耐药菌株不断增加，因各种侵入性医疗措施的开展，医院感染在逐年递增，且引起感染的菌种也在不断发生变化。据文献报道11121，在医院感染的各种致病菌中，早期以革兰氏阳性菌为主，尤其是金黄色葡萄球菌，从20世纪70年代开始革兰氏阴性菌逐渐增多，其中由大肠埃希氏菌引起的感染居多，大约占医院感染的152IL”。医院感染又名院内感染NOSOCOMIALINFECTION，是指患者入院时不存在亦不处于潜伏期，在医院内获得的感染，包括内源性感染、病人与病人之间的交叉感染及社会感染在医院里的传播【L4J等。国内外有关研究表明，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA和凝固酶阴性的葡萄球菌、耐万古霉素的肠球菌VRE、产超广谱13一内酰胺酶EXTENDEDSPECTRUMBETALACTAMASES，ESBLS的大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌及铜绿假单胞菌是医院感染的常见病原菌152Q。并有研究表明，在不同感染中，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别位于前十位致病菌的第一、五位口”。医院感染不仅与医疗过程中导管、插管、输液、手术等交叉感染有关，也与医院环境中的医护人员手、物体表面、空气等有一定关系【22】。为了解医院病房致病菌的构成及分布状况，探讨不同科室耐药金葡菌及大肠杆菌的分布情况、耐药机制及各病房菌株间的同源性关系等，我们于2005年34月从兰州市两家省级医院五个科室的医务人员手、医疗器械、物体表面、空气等采样，并进行细菌分离鉴定及同源性分析，为有效控制院内感染提供依据。材料与方法1材料及仪器11材料及试剂各种生化管及试剂杭州天和产品；基础及鉴别培养基杭卅L微生物试剂有限公司均按厂家说明的方法配制；生理盐水甘肃扶正药业产品；兔血浆兰州大学实验中心提供。12主要仪器设备高压灭菌器YX280B上海三申医疗器械厂，中围；电子天平IS0900TGAMR公司，德国恒温震荡箱THZ98A上海一叵科技仪器公HTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文司，中国；恒温培养箱PYXDHS3540上海跃进医疗器械厂，中国。2方法21临床标本采集选择兰州市A、B两所省级医院的外科重症监护ICU、烧伤科、新生儿科、普外科共五个科室进行同期采样，从各科室的病房物表、空气及医护人员手等随机采样，每月采样一次，连续采样两次。根据医院消毒监测技术规定的采样方法，物表采用棉拭子采样法，空气采用平皿沉降法。22细菌采样方法221物表采样法1奇55CM的空格贴于物表表面，用沾有无菌生理盐水的棉试子在被检物体表面沿一个方向按一定顺序擦洗；不规则物表则沿里外的顺序涂抹。将擦拭的棉拭子放入5ML无菌生理盐水中，用力振荡洗脱后用无菌吸管吸取1ML，用无菌接种环均匀涂布于培养基表丽，37。C培养24小时后分离鉴定。222空气采样法根据采样病房大小，在每个房间的东西南北中分别放置5对或3对血琼脂和麦康凯培养皿，暴露5MIN，立即收取平皿，37温箱培养24H。223医护人员手的采样方法受检者将五指并拢，用浸有无菌生理盐水的棉拭子在双手手指曲面从指根到指端来回涂擦各5次，剪去手所接触的部分后，将棉拭子放入盛有5ML无菌生理盐水或相应中和剂的试管中。23细菌的分离纯化将采集的标本涂布于血琼脂平板及选择性培养基麦康凯琼脂或高盐甘露醇琼脂平板上，置37。C温箱中培养24H后取出，观察菌落的生长情况。选取典型单个菌落接种到普通琼脂平板上，置37。C温箱中培养24H后，进行细菌鉴定。24细菌的鉴定参照临床微生物学及检验1231及全国L临床检验操作规程讲1第二版，结合细菌生物学、形态学特性及生化反应等进行细菌鉴定。241金黄色葡萄球菌的鉴定2411培养特性及形态学染色将其纯培养物，接种于血琼脂和高盐甘露醇琼脂平板上，观察培养基上病原菌溶血及生长情况。取纯培养物涂片，用革兰氏染色、镜检，观察病原菌的形态大小及排列方式等。2412凝固酶实验采用玻片法，用一滴生理盐水将生长良好的1个单菌落在玻片上乳化，并用接种环蘸取兔血浆一环，混匀后观察凝集现象。2413糖醇发酵试验耿纯培养物接种于葡萄糖发酵管及甘露醇发酵管中，标汜菌株号码，置37恒温箱中培养1824H后观察各发酵管的反应情况。2414生化试验取纯培养物分别做触酶试验、高盐耐受试验等，观察其反应。HTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文241，5判断标准1其纯培养物经涂片革兰氏染色镜检，可见球形、大小不一、呈葡萄串状排列的革兰氏阳性菌。在普通琼脂平板上可形成圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润、有光泽的中等大小菌落，并有金黄色色素产生；在血琼脂平板上形成的菌落较大，菌落周围有透明溶血环；在高盐甘露醇琼脂平板上48D时后形成典型菌落，并使培养基变为淡黄色。2凝固酶实验中，将生长良好的单菌落经生理盐水乳化，然后用接种环蘸取一环兔血浆混匀，经10秒钟可有白色颗粒状物质产生。3受试菌株全部发酵葡萄糖产酸不产气，均可分解甘露醇，使发酵管变黄。4其生化试验结果为耐高鼎、触酶实验阳性，其它各项均符合金葡菌生化特征。242大肠杆菌的鉴定2421培养特性及形态学染色将上述纯培养物，接种于麦康凯和血琼脂平板、三糖铁琼脂上，观察培养基上的病原菌生长情况。取纯培养物涂片，用革兰氏染色、镜检，观察病原菌的形态、大小与排列方式。2422糖发酵试验参考文献自制各种糖发酵管，取纯培养物接种于各种糖发酵管中，标记菌株号码，置37。C恒温箱中培养1824H后观察各发酵管的反应情况。24，23生化试验各种生化试剂按文献251要求自制。取纯培养物分别做MR试验、VP试验、尿素酶测定、硫化氢试验、吲哚试验、枸橼酸盐利用实验、靛基质试验，观察其反应。2424判断标准1纯培养物经涂片革兰氏染色镜检，可见到有敖在的两端钝圆、中等大小的革兰氏阴性菌。细菌培养在肉汤中表现为一致混浊，管底有灰白色沉淀，在普通琼脂平板上可见有灰白色半透明、圆形、凸起、湿润、边缘整齐的中等大小的菌落；在麦康凯琼脂平板上呈均匀红色菌落；三糖铁琼脂高层中斜面产酸，培养基变黄底部产酸产气，培养基变黄有气泡产生。2供试菌株在糖发酵管中发酵乳糖、产酸产气均不与肌醇反应。3其生化反应结果为MR试验、靛基质试验、吲哚试验呈阳性VP试验、尿素酶测定、HS实验、枸橼酸盐实验呈阴性。25资料处理按统一标准建立数据库，应羽SPSSIO0软件对有关数据进行统计分析。26质量控制实验前对相关人员统一进行专业培训，技术路线经反复论汪后通过预实验熟练实验过程，发现问题及时纠正后全而启动正式实验，各项实验严格按照要求进行规范、无菌操作。HTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文结果1病原菌的一般检出情况本次从两家省级医院五个科室的医护人员手、医疗器械、物表、空气等共采样196份，43份标本培养无细菌生长，细菌培养阳性标本153份，共得常见致病菌380株，其中革兰氏阳性菌195株，占513，革兰氏阴性菌185株，占487。在革兰氏阳性菌中金黄色葡萄球菌检出15株，检出率为77。革兰氏阴性菌中，鲍曼不动杆菌和大肠杆菌的检出率较高，检出率分别为163、128。各病原菌的检出情况不同Z2583998PO05R盒筒1971PD3两所医院不同科室两种致病菌的检出情况分离的25株大肠杆菌，16株来自A院，其分离率为12516128，9株来自B院，分离率为132968。细菌科室分布普外科检出率为211838，A院ICU病房达156532。所分离的15株金葡菌主要集中在A院新生儿科，分离率为167。见表13。两种菌在两院的分离率均无显著性差异X20022，PO05；1548，PO05，A、B两院相同病房ICU病房金葡菌及大肠杆菌的检出率也无统计学意义矿1455，PO05；X2自O048，PN酊上表1_3两所医院不同科室两种致病菌的检出情况TABLE3THEADMINISTRATIVEDISTRIBUTIONOFTHEECOLIANDSAUFROMTWOHOSPITALZ2目5632，PO05；妒5707，PO05HTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文讨论医院感染是目前医学界所面I商的严重问题，同时睦L是世界人民关注的热点问题，不仅影响人们的生活质量，同时也造成经济的巨大损失。研究表明121在医院感染的致病菌中，早期以革兰氏阳性菌为主，从20世纪70年代开始革兰氏阴性菌逐渐增多，并超过革兰氏阳性菌的感染。有文献报道26281，各种病原菌在LF每床感染标本检出中，革兰氏阳性菌主要有金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及凝固酶阴性葡萄球菌等；革兰氏阴性菌主要有大肠埃希氏菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌等，其中致病性大肠杆菌的分离率在逐年增加。本次研究结果显示，从196份样本中共分离到病原菌380株，其中革兰氏阳性菌195株，革兰氏阴性菌185株，分别占总检出菌的513、487。本次研究结果显示检出的革兰氏阳性菌主要有微球菌、表皮葡萄球菌及金葡菌等，革兰氏阴性菌主要有鲍曼不动杆菌和大肠杆菌等，与文献报道相似，不同之处在于本次检出菌中，金葡菌和大肠杆菌均不是医院常见感染菌中检出率最高的菌种，而在以往研究中这两种菌均位于首位，这与细菌标本来源及科室采集不同等因素有关。国内有关研究ZGL表明，病房空气中的含菌气溶胶颗粒及各种物体表面的细菌、医护人员手的污染是造成院内交叉感染的主要原因。空气污染是疾病传播的主要媒介之一，病原体可在室内有较长的存活时间，如金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、沙门氏菌、致病性弧菌等均可存活15天以上。医护人员因手接触病人及污染物品的机会多，易将病原体通过手传递给其他病人或用品，从而造成间接污染。另外，探视及陪护人员也可将病原菌带入病区或病房从而造成易感人群发病。本次分离到的25株大肠杆菌，主要分布在空气、病人床单及物体表面等处，且经定性检测后发现，物体表面检测出的大肠杆菌主要分布在床头柜、床头及水龙头等，提示这些菌株的来源可能是病人直接污染床头和床头柜，并接触水龙头后导致其污染。而所分离的15株金葡菌依次分布于陪护人员手、病人床单、空气等处，从治疗车、水龙头及床头也各分离N1株金葡菌，可能因陪护人员或病人接触了床头及水龙头而使其污染治疗车的污染是因治疗过程中的治疗物品和医护人员手在病房受到污染后所致。本次检测结果显示，两种菌从病人床单和空气的分离率均较高，提示病房环境消毒效果欠佳，空气清洁度较低。又因医院环境中的致病菌可赢接或间接引起院内感染流行，因此医院需加强病房环境的消毒作，净化病房空气，给病人提供一个舒适、清洁、安全的环境。本次从医护人员手分离N2株大肠杆菌，但未HTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文分离到金葡菌；从医疗器械检测到1株金葡菌，未分离到大肠杆菌，其结果提示，病原菌可通过医护人员手及医疗器械等造成院内交叉感染，同时提示医护人员手及医疗器械的消毒不彻底，医院急需对此进一步加强，这对控制院内交叉感染，降低感染率有重要意义。两种菌在两所医院各科室的分布情况不同，其中大肠杆菌从B院普外科的分离率最高，达211，其次为A院ICU病房，分离率为156。金葡菌在两院各科室的分布状况也不同，A院新生儿科金葡菌分离率最高，共分离至LJ6株，分离率为167；其次为A院烧伤科，分离到4株；两院ICU病房各检到金葡菌2株。由检测结果可知，大肠杆菌主要分布在普外科、ICU病房，而金葡菌则多分布在新生儿科，各病房有不同的潜在优势致病菌存在，因而医院应根据各科室致病菌的分布特点及构成采取相应的措施，以有效防止及控制院内感染的发生。综上所述，本次病房环境病原菌定性检测结果显示，医院病房环境的消毒效果欠佳，空气清洁度较低，其污染程度与医院感染有一定联系，或存在潜在引起院内交叉感染的危险，病房中存在医护人员医疗器械病人物表各环节间的交叉感染，医院应按照医院消毒技术规范要求，严格执行消毒隔离制度，健全监督措施，加强消毒技术规范执行中的环节管理和终末管理有目的有选择地进行环境定期采样及卫生学监测；加强工作人员的无菌观念及自身防护意识，切断各种院内、院外感染途径，从而有效控制院内交叉感染、环境外源性感染及自身感染等的发生。HTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文第二部分金葡菌及大肠杆菌的耐药性及同源性分析日U舌金黄色葡萄球菌是临床常见的致病菌之一，是引起化脓性疾病毒力最强的化脓菌。由于其可以产生浴血毒素、肠毒素、血浆凝固酶、耐热核酸酶等毒素和酶，在临床上可引起外伤化脓、子宫内膜炎、乳腺炎等各种感染，若治疗不及时常引起败血症而死亡。随着抗生素的广泛应用，金黄色葡萄球菌的耐药性越来越高，其耐药菌株引起的医院和社区感染正逐年增加，已引起人们的高度重视【30】。目前从临床分离的金黄色葡萄球菌几乎都为耐药菌，且为多重耐药菌，给临床治疗带来极大困难。尤其值得注意的是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA，除万古霉索外几乎无药可治，且目前又出现了对万古霉素中敏的金黄色葡萄球菌，致使金黄色葡萄球菌的耐药性问题成为人们关注的焦点之一【3132L。大肠杆菌是人类肠道的正常菌群，又是重要的条件致病菌，对于免疫缺陷、粒细胞缺乏等患者，极易通过多种形式和途径侵入肠道外的组织和器官造成各种严重感染。目前由其引起的医院感染在国内外均呈上升趋势，耐药性也因耐药质粒的转移而不断发生变迁口31。耐药质粒可通过各种医源因素医务人员手、医疗器械、物表、空气等1的传递加速耐药性在各病房菌株之间的传播，从而造成医院感染流行。据此，本实验就医院病房分离的15株金葡菌和25株大肠杆菌及同期从医院检验科收集的12株大肠杆菌通过药敏试验、质粒消除、质粒转化及质粒图谱和限制性内切酶图谱等分子生物学技术进行研究，以了解金葡菌及大肠杆菌的医院分布状况、耐药机理、同源性关系及其引起的医院感染途径等，进而为预防控制院内感染提供依据。1材料及仪器11主要材料及试剂材料及方法抗生素纸片杭州微生物制剂厂，中国。MH培养基杭州微生物制剂厂，中国。LB培养基上海伊华医学科技有限公司，中困。限制性内切酶ECORI华美生物工程公司，中国。HTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文RNASEI上海生物工程公司，中国。ECORI酶上海生物工程公司，中国。溶菌酶BBI产品。药敏质控标准菌株甘肃省检验中心，中国。PUCL9华美生物工程公司，中国。溴化乙锭WBL0509FLUKA公司，瑞典。12主要仪器设备恒温震荡箱THZ98A上海一恒科技仪器公司，中国。恒温培养箱PYXDHS35X40上海跃进医疗器械厂，中国。高压灭菌器YX280B上海三申医疗器械厂，中国。超净工作台VS1300一U苏净集团安泰公司，中国。电子天平IS09001GAMR公司，德国。微量加样器QCYFC012001上海雷勃分析仪器公司，中国。低温超速离心机5415RGAMR公司，德国。旋涡混合器MVS1北京东方生物科学器材公司，中国。水平凝胶电泳槽GYCP31BM北京市六一仪器厂，中国。稳压电泳仪DYY一6B北京市六一仪器厂，中国。紫外透射分析仪GIS2010上海一恒科技仪器公司，中国。2实验方法21菌株来源选择兰州市两所省级医院的外科重症监护ICU、烧伤科、新生儿科、普外科共五个科室进行同期采样，从各科室病房的物表、空气及医护人员手等随机采样，每月采样一次，连续采样两次。根据医院监测消毒技术规定的采样方法，空气采用平皿沉降法，物表采用棉拭子采样法。同期从A院检验科收集至1J12株大肠杆菌，用半固体培养基保存。22细菌鉴定根据L涵床微生物学及检验1“231对采集的标本进行常规处理，并按照全国临床检验操作规程241进行细菌鉴定。23药敏实验231药敏纸片药敏纸片包括青霉索PG、头孢哗啉CEZ、头孢三嗪CRO、新生霉素NB、环丙沙星CNX、红霉素ERY、庆大霉素GEN、克林霉素CLN、头孢西丁FOX、万占霉素VAN哌拉西林PIP、亚胺培南IMP1、氨曲南ATMHTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文及复方新诺N蝈SMZ。232标准菌株以金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠杆菌ATCC25922作为质控菌株。见图21、图22。图21标准金葡苗药敏图22标准大肠杆菌药敏HTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文234MH培养基将369粉末溶,N1000ML冷蒸馏水中混和放置20分钟隔石棉铁丝网微火煮沸至完全溶解，于121高压灭菌15分钟，冷却至60。C左右倾注无菌平皿。235实验方法及结果判定采用改0,KIRBYBALLER；法，按美国国立临床实验室标准化委员会NCCLS2001年版的规定标准判读结果。1挑取生长良好的一单菌落于2ML生理盐水中制成悬液，充分混匀。2用无菌棉拭子蘸取上述菌液，在管壁上挤压除去多余的液体，均匀涂布在MH培养基上。3用无菌镊子小心夹取药敏纸片，贴在涂有细菌的MH培养基上，置于37温箱培养1618D,时。4用游标卡尺量取抑菌环大小，并按美国国立L临床实验室标准化委员会NCCLSL2001年版的规定标准判读结果，在判读过程中按照三盲法读取后取其平均值。24质粒DNA提取241质粒标准菌株PUCL9269KB华美生物工程公司，中国242培养基1LB固体培养基将389粉末溶A1000ML冷蒸馏水中混和放置20分钟隔石棉铁丝网微火煮沸至完全溶解，于121高压灭菌15分钟，冷却至60倾注无菌平皿。2LB液体培养基胰蛋白胨109酵母提取物59NACL109蒸馏水1000ML将上述成分溶于水中，调整PH为7O75，分装试管，每管约25ML，115高压灭菌15分钟，用于活化细菌。243试剂RNASEI上海生物工程公司；溶菌酶BBI产品酚、氯仿无水乙醇、70乙醇均为天津市化学试剂厂产品。1溶液I50MMOLL葡萄糖25MMOL几TRIHCLPH8010MMOL几EDTAPH802溶液II20MGML溶菌酶仅用于金葡菌02MOLLNACL1SDS临用前新鲜配制HTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文3溶液III4TE缓冲液3MOLL2MOLL10TOOLLLMMOLL乙酸钟冰乙酸PH46TRIHCLEDTAPH8O244质粒DNA提取方法由于金葡菌的细胞壁坚厚，抽提质粒时主要使用SIGMA公司的溶葡萄球菌素。但浚试剂价格昂贵，本文采用一种改进的KADO和LIU361质粒抽提法，应用溶菌酶和十二烷基磺酸钠SDS代替溶葡萄球菌素，对金葡菌进行质粒抽提。参考文献并略作改进后，采用改良碱裂解法D刀对大肠杆菌进行质粒抽提。1挑取单菌落于5MLLB培养液中，37。C振荡培养过夜。2取15ML菌液分装于EP管中，于412000RRAIN离心05分钟。3弃去培养液，将EP管倒置于吸水纸上，使细菌沉淀干燥。4在细菌沉淀中加入100“L用冰预冷的溶液I含终浓度20UGML的RNASE1，剧烈振荡使沉淀溶解，室温放置35MIN。5力W200BL溶液II现配现用，颠倒混匀5次，冰浴510分钟；6加15毗L溶液I后混匀，冰浴5分钟。74“C12000RMIN离一6,5分钟后，吸取上清于一新的离心管中。8加酚、氯仿各20毗L，颠倒混匀，室温放置10分钟，8000FFRAIN离心5分钟，J、心吸取上清于一新的离心管中。9加双倍体积用冰预冷的无水乙醇沉淀双链DNA，置20冰箱放置40MIN。104。C12000RRAIN离心5分钟，弃上清，将EP管倒置于吸水纸上，使沉淀干燥。11力NLML用冰预冷的70乙醇，4“C12000RMIN离心1分钟。12弃上清，将EP管倒置于吸水纸上，使沉淀自然干燥。13用2毗L水或TE冲洗管壁，溶解沉淀，置20。C冰箱备用。25琼脂糖凝胶电泳251试剂15XTBETRIS硼酸2凝胶加样缓冲液6X05MOLLEDTA蒸馏水澳酚蓝5409275920ML1000M1PH80025HTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰州大学硕士学位论文3溴化乙锭溶液EB4琼脂糖5MARKER252仪器蔗糖400O5UMLBBI产品KECORLHINDLLI水平凝胶电泳槽GYCP31BM北京市六一仪器厂，中国稳压电泳仪DYY一6B北京市六一仪器厂，中国紫外透射分析仪GIS2010上海一恒科技仪器公司，中国微量加样器QCYFC012001上海雷勃分析仪器公司，中国253方法1制胶称取一定量的琼脂糖放入锥形瓶中，加入05XTBE缓冲液，配置1O琼脂糖凝胶，冷却至60。C后J11,EB使其终浓度为O即GML。将凝胶注入水平式电泳槽内。待胶凝固后，取出梳子，加入电泳缓冲液至电泳槽中。2加样用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样IL记录点样顺序及点样量。3电泳接通电泳槽与电泳仪的电源，调整电压至80V，当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12CM处，停止电泳。4拍照紫外透射仪下观察结果、拍照并记录电泳结果。用标准质粒分子量的对数与迁移距离建立对应关系，以样本质粒迁移距离计算质粒分子量的大小。26质粒消除试验261试剂0025SDSLB液体培养基262方法按李倩等381改良法，采用0025SDS和43。C高温双重处理进行质粒消除实验。具体方法如下将耐药菌接种于含0025SDS2MLLB肉汤管中，43。C振荡培养16H；取2Q“L菌液接种于无SDS2MLLB肉汤管中，43。C培养16H；取2毗L菌液，接种于含0025SDS2MLLB肉汤管中，43。C培养16H；取2Q“L菌液接种于5MLLB肉汤管中，37。C培养16小时。做小量质粒抽提检测质粒消除情况，若未消除，重复上述操作，直至质粒完全消除后做药敏试验。27质粒转化试验271材料及仪器HTTP/WWWNTNKYYCOM/南通男科医院兰,ITL大学硕士学位论文1材料氨苄青霉素，大肠杆菌DH5。，PUCL9质粒，离心管，吸头等。2试剂LB液体培养基，LB固体培养基，O1MOLLCACL2溶液，100MGML氨苄青霉素溶液100MGM1。3仪器超净作台，低温离心机，恒温摇床，恒温箱，恒温水浴箱。272方法参考文献1361，采用CACL2法，做质粒转化实验。1感受态细胞的制备取DH5。接种于5MLLB肉汤培养基中，37。C振荡培养过夜，取05ML菌液接种于50ML新鲜的LB肉汤中二次活化培养，37。C振荡培养2H。取10ML菌液至一离心管，冰上放置10MIN后，4000RMIN4。C离一T二,10MIN，弃上清，JH2ML冰预冷的01MOLLCACL2悬浮沉淀，冰浴30MIN4“C离心4000RMIN10RAIN，回收细胞。弃