免疫组化基本理论.ppt

1、1,*. 完全抗原(Complete antigen): 大多数蛋白质和部分大分子多糖等, 分子量(MW)大. *. 半抗原(Hapten): 大部分多糖, 类脂和多肽等, MW小. 仅具免疫反应性. *. 半抗原抗体的生成: 用戊二醛等将钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin, KLH), 牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA), 卵白蛋白(Ovalbumin, OVA)或甲状腺球蛋白(Thyroglobulin )等大分子(载体, Carrier)和MW小的半抗原结合后免疫动物. 但机体可产生载体抗体.,2,2. 特性: a. 异物性:

2、 *. 异种或同种异体物质: 种属关系越远免疫原性越大, 交叉反应越弱. 反之亦然. *. 自身组织: 特殊情况下释放隐蔽的抗原引起自身免疫. b. 理化特性: 分子量10kDa, MW越大, 结构越复杂免疫原性越强. c. 特异性: 抗原具有只与相应抗体发生结合反应的特性, 其物质基础是抗原分子表面少于8个氨基酸, 糖或核苷酸残基构成的表位(Epitope)或称抗原决定簇(Antigenic determinant). *. 抗原一级和空间结构影响抗原决定簇. *. 抗原决定簇越多, 间距越大, 免疫原性越大. *. 酶解或变性可暴露蛋白内部的抗原决定簇.,3,在氨基端(N端), 重链的1/

3、4和轻链的1/2组成可变区(Variable region, V区), 其氨基酸排列顺序变化很大, 用于结合不同的抗原决定簇. 在羧基端(C端), 重链的3/4和轻链的1/2组成稳定区(Constant region, C区), 其氨基酸排列顺序比较恒定.,B. 抗体: 免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig). 1. 分子结构: 一对重链(Heavy chain)和一对轻链(Light chain)通过二硫键连接成对称性的“Y”形.,4,2. 功能结构: a. 抗原结合片段(Antigen binding fragment, Fab): “Y”顶部. 每个Fab由一条完整的轻链和一

4、条不完整的重链组成. 因一个抗体有两个Fab, 因此可结合2个抗原. b. 可结晶片段(Crystallizable fragment, Fc): “Y”基部.由两条不完整的重链组成, 可与补体等结合, 是调节抗体生物活性的部分. c. 绞链区(Hinge region): 连接Fab和Fc的狭窄区, 易弯曲扭转或被木瓜酶和胃蛋白酶解. *. 调理作用(Opsonization): 免疫细胞对IgG结合的抗原反应迅速且激烈, 因为这些细胞本身有IgG的Fc受体. 3. 抗原性: 抗体分子量约150kDa, 具有抗原性.,5,4. 分类: a. IgG: 最多. 是能穿过胎盘屏障的唯一类型. b

5、. IgA: 分泌物中的主要类型. 蛋白J结合23个IgA单体, 并与分泌蛋白结合后形成分泌性IgA(SIgA). c. IgM: 免疫反应中首先出现的类型. B细胞CM上单体IgM与抗原的结合, 对B细胞转变成浆细胞非常重要. 血循环中五聚体IgM与抗原结合后, 能激活补体系统, 该系统包括肝脏合成的C3等20余种蛋白, 能增强免疫反应. d. IgD: B细胞CM, 功能不明. e. IgE: 其Fc段与肥大细胞CM的Fc受体结合, 引起脱颗粒造成过敏反应(Allergy).,6,小肠上皮吸收细胞与M细胞合作, 形成分泌性IgA (SIgA).,7,IgE的Fc段与肥大细胞CM结合, 引起

6、脱颗粒, 造成过敏反应.,8,5. 生成: a. 多克隆抗体(Polyclonal antibody): *. 抗原分子上有许多不同的抗原决定簇, 免疫动物体时 每个抗原决定簇激活一种合成抗体的细胞克隆, 产生许多种lgG (针对同一抗原的多种抗体混合物), 即多克隆抗体. *. 多克隆抗体易与类似抗原(即含类似抗原决定簇)发生交叉反应. *. 多克隆抗体分离自动物血清, 也称抗血清. b. 单克隆抗体(Monoclonal antibody): *. 用特异性抗原免疫小鼠, 分离抗体产生细胞. *. 与不产生抗体但能不断增殖的细胞系骨髓瘤细胞融合, 形成杂交瘤(Hybridoma). *.

7、将杂交瘤细胞克隆化, 每个杂交瘤细胞只产生一种抗体, 对一个抗原决定簇发生反应, 即单克隆抗体.,9,C. 抗原-抗体反应: 抗原和抗体发生特异性结合, 解离系数10-11M. 抗原-抗体反应的高度特异性, 高亲合力及形成不溶性复合物等特性是免疫组化的基础. II. 常用标记物及其检测: 荧光染料, 酶, 生物素和胶体金等用于标记抗体, 抗原, 蛋白A和凝集素等. A. 荧光染料: 1. 简介: 即荧光色素, 能吸收特定波长的高能量光波而受到激发(Excitation), 进而以特定波长(荧光)将能量发散(Emission). a. 异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocya

8、nate, FITC): 490552030nm, 黄绿色. b. 四甲基异硫氰酸罗达明(Tetramethyl rhodamine isothiocyanate, TRITC): 550620nm, 橙红色.,10,FITC-conjugated 2nd antibodies show tubulins, PI shows nucleus in Hela cells,TRITC-conjugated 2nd antibodies show vimentins, FITC-conjugated phalloidin shows actins, DAPI shows nuclei in cult

9、ured AGMKC (African Green Monkey Kidney Cells, Vero cell line),11,c. 羰花青(Carbocyanine)系列: *. Cy2: 489506nm. 绿色. *. Cy3: 550570nm. 红色. *. Cy5: 650670nm. 暗红色.,The Cy3-conjugated 2nd antibodies show microtubular network, and DAPI shows nucleus in PtK2 cells.,d. Alexa Fluor系列: *. 488: 495519nm, 绿色. *. 5

10、68: 578603nm, 红色.,Alexa Flour 568- conjugated 2nd antibodies show tubulins, Alexa Fluor 488 conjugated-phalloidin shows actins, DAPI shows nucleus.,12,e. Dylight系列: 对pH改变不敏感, 容易激发荧光强烈且淬灭时间长. *. DyLight 350353432nm. *. DyLight 488493518nm. *. DyLight 549562576nm. *. DyLight 594593618nm. *. DyLight 63

11、3638658nm. *. DyLight 649654673nm.,Dylight 488-2nd anti-GFAP, DAPI shows nuclei. Nerve tissue.,Texas Red, DyLight594和Alexa594的发散荧光比较,13,f. 德克萨斯红(Texas red): 595620nm, 红色荧光. 除抗体外还可标记鬼笔环肽等. g. 氟硼二吡咯(Bodipy)系列: 除抗体外还可标记鬼笔环肽, 蛋白, 核苷酸和糖脂等. *. BODIPY TR: 589617nm, 红色. *. BODIPY FL: 503512nm, 绿色.,BODIPY FL

12、-conjugated 2nd antibodies show alpha-tubulins, Texas red conjugated-phalloidin shows actins, DAPI shows nucleus in cultured bovine pulmonary artery endothelial cells,14,2. 荧光抗体的制备： a. 原理: 在碱性环境下, FITC或TRITC的异硫氰酸基(Isothiocyanic acid group)与抗体的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键(Sulfur carbon amino key). 一个抗体分子上最多可标记1

13、520个FITC分子. FITC常用于单染, 而TRITC常与FITC一起用于双重染色. b. 方法: (略).,15,B. 酶: 1. 常用标记酶: 辣根过氧化物酶(Horse radish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(AKP)等. 酶应具备以下条件: a. 酶催化的底物有特异性的, 而且易于显示. b. 酶反应终产物必须是不溶性的, 而且稳定不易扩散. c. 易于获得纯酶分子, 且性质稳定. d. 酶标记抗体后, 不影响酶的催化活性和抗体的免疫活性. e. 被检组织中不应存在内源性酶或酶的底物, 如果有应能彻底被灭活.,16,2. 酶标抗体的制备: 利用双功能交联剂戊二醛

14、(Glutaraldehyde)的醛基(Aldehyde group)与酶和抗体的氨基(Amino group)共价结合形成酶标抗体; 或用过碘酸钠(Sodium periodate, NaIO4)将酶表面的糖分子氧化成醛基(Aldehyde group), 然后与抗体的氨基结合. 3. 方法: (略).,17,4. 酶标记物的检测: 在特定pH和温度下加入特异性底物, 形成不溶性有色(LM)或电子密度产物(EM). a. AKP的显示: *. 金属沉淀法: pH9.09.6时, AKP水解甘油磷酸钠等释放出PO43-, 后者依次与Ca2+和Co2+结合, Co2+再与S2-结合形成CoS有色

15、沉淀. *. 偶氮色素法: AKP水解底物萘酚磷酸盐, 释放出来的萘酚衍生物与固红(Fast red)结合形成不溶性红色偶氮, 或与固蓝BB结合形成不溶性蓝色偶氮, 从而使酶活性特异定位.,18,LDH (Lactic dehydrogenase) immunostaining. H counterstain. Human placenta.,19,b. HRP的显示: 底物是H2O2, 释放出氧, 将电子供体氧化, 产生有色终产物. 常用的电子供体有二氨基联苯胺(Diaminobenzidine, DAB), 4-氯-1-萘酚(4-Chlorine-1-alpha-naphthol, CN)

16、, 四甲基联苯胺(Tetramethylbenzidine, TMB)和3-氨基-9-乙酰卡巴唑(3-amino-9-ethylcarbazole, AEC) 等, 分别产生棕, 蓝, 蓝和红色产物. DAB显色后可用任何复染剂, 但CN, AEC及AKP的显色完成后只能用水溶性复染剂如甲绿和HE.,20,*. DAB显色法: 被氧化后形成的棕黄色多聚体可永久封固, 还可与OsO4螯合用于EM, 因此DAB虽有致癌性但仍被广泛应用. 配法: 将50mg DAB溶于 100ml 0.1M pH7.6 TB中, 过滤后加入33l 30%H2O2, 显色15分.,PAP法. DDX4 MVH (Pr

17、imordial Germ Cell Marker) positive. Mouse,21,*. AEC显色法: 为DAB的替代物或用于双重染色. 红色反应产物可溶于脂类溶剂, 易扩散消褪, 必须湿封并需尽快照相. 配法: 将20mg AEC溶于0.5ml 二甲基甲酰胺(Dimethylformamide, DMF)中, 加入9.5ml 0.05M pH5.0 醋酸缓冲液和3%H2O2 3滴, 室温下显色510分.,22,*. TMB显色法: 脂溶性, 深蓝色反应产物不溶于有机溶剂, 故可干封, 但褪色快需迅速照相. Co化后黑色. 配法: A液中含DDH2O 92.5ml, 100mg亚硝基

18、铁氰化钾(Potassium nitroprusside)和5ml 0.4M pH3.3醋酸盐缓冲液. B液为溶解5mg TMB的2.5ml纯酒精. 混合A, B液后加入30%H2O21050l, 显色20分.,*. CN显色法: 无致癌性, 可与DAB结合用作双重染色. 蓝色反应产物可溶于脂类溶剂, 易扩散消褪, 必须湿封并需尽快照相. 配法: 将3mg CN 溶于0.5ml 纯酒精中, 加入9.5ml 0.1M pH7.6TB, 再加3滴3H2O2, 显色510分. 加热到50可加强着色.,23,C. 生物素(Biotin): 1. 性质: 水溶性维生素H, 分子小结构简单, 不影响被标记

19、物的理化特性及免疫学特性. 通过其羧基与蛋白质氨基等结合从而标记抗体, 酶, 凝集素, 激素和核酸探针等, 但不能标记荧光素和胶体金.,2. 生物素-抗生物素蛋白(Avidin, 亲和素): 抗生物素蛋白是从卵白中提取的糖蛋白, 1A+4B的解离系数10-15M. 3. B标记抗体的制备: (略).,24,4. B的显示法: 提前将A与B标记的HRP按一定比例混合制成ABC复合物, 使A表面至少有1个B结合位点保持游离, 形成带有HRP的抗原-抗体复合物. 以此复合物结合B标记的抗体, 最后组化显示HRP.,大鼠下丘脑GnRH阳性神经元 ABC法染色, DAB-H2O2显色. 西安交通大学医学

20、院解剖与组胚专业博士生周劲松, 1999.,25,NOS (Nitricoxide synthase) eNOS immunostaining. Growth hormone immunostaining. Human pituitary pars distalis.,26,D. 胶体金(Colloidal gold): 主要用于EM免疫标记. 1. 特性: 电子致密, 疏水性, 无细胞毒, 稳定. 蛋白质的正电基团与带负电的胶体金颗粒通过静电吸引而形成稳定的复合物. 金颗粒电子密度很高, 不需特殊处理即可用于TEM. 在电子束的打击下, 可发射二次电子, 也可直接用于SEM. 大于10nm的

21、金颗粒在LM下呈粉红色. 故还可用于LM. 2. 胶体金和金标抗体的制备: (略).,27,胶体金染色的LM和EM观察,28,III. 免疫组化基本条件 A. 基本原则: 1. 不损坏组织和细胞的原有结构. 2. 高度敏感性, 可检出微量抗原物质. 3. 高度特异性, 基于抗原-抗体反应. 4. 定位准确, 不引起被检物质的扩散. 5. 反应产物可见, 与背景反差强烈. B. 组织抗原的保存与暴露: 与一般组化处理类似. 1. 固定, 包埋和切片: 与组化过程类似. 2. 提高抗原活性: 可引起脱片. a. 蛋白酶消化: 醛固定剂使抗原被遮蔽(Masking), 使用蛋白酶消化可以恢复抗原的反

22、应性去遮蔽(Unmasking). 常用的蛋白酶有胰蛋白酶(Trypsin)和链霉蛋白酶(Pronase)等. b. 抗原修复(Antigen repairing/recovery): 应用微波, 水浴锅和高压锅等高温高压对石蜡切片进行处理.,29,c. 提高组织穿透性(Penetrability): 增加抗体-抗原的反应机会. *. 用非离子型表面活性剂(去污剂和清洁剂)如聚乙二醇辛基苯基醚(p-Octyl polyethylene glycol phenyl ether, Triton X-100, 曲拉通)或皂角苷(Saponin)等溶解脂质. *. 将已固定并粘附于载玻片的标本通过上升乙醇到二甲苯, 然后经下降乙醇至水. *. 先将标本经蔗糖防冻处理, 再置低温下(如将玻片放置-70低温冰箱或以干冰致冷的金属板上)迅速冷冻, 然后室温完全融化, 如此重复23次, 反复冻融.,30,C. 特异性抗体: 针对待检抗原的特异性抗体称为第一抗体(Primary antibody, 一抗), 针对一抗的特异性抗体称为抗抗体或第二抗体(Secondary antibody, 二抗). 1. 对抗体的要求: 抗体必需具备的高特异性, 高亲合力和高滴定度(Titer)与抗原决定簇的结构有关. 常用等电聚焦(Isoelectrofocusing)和亲合层析(Affinity chroma