蛋白纯化层析柱--GE 详细介绍

1、蛋白纯化层析柱-ge 详细介绍 蛋白纯化层析柱 xxxx年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是. 关键词：蛋白离子交换分离分子物质树脂 从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术（gel filtration，gf），离子交换层析技术（ion exchange，iex），羟基磷灰石层析（hydroxyap

2、atite，hap）和疏水作用层析（hydrophobic interaction，hi)，以及亲和层析和高效液相色谱方法（high-performance liquid chromatography，hplc）。 对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。ge healthcare（原amersham biosciences）的技术顾问andrew mitchell解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步： 捕获从细胞其它成份，比如dna和rna中分离需要的蛋白； 区分从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学

3、特征的污染物中分离蛋白； 修饰使分离得到的样品处于可使用状态。 这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。 第一步捕获步骤，也就是从细胞裂解物粗成份中分离蛋白，这需要一个具有高容量和高流量（flow rate）的填料。bead大小比较大，范围比较宽（比较于bead大小平均值）的“f ast flow”填料比较理想，这种填料也有利于防止目标蛋白被水解因为速度比较快。 第二步则对分辨率要求更高，需要更好的从混合物中分离需要的成份。通常bead的大小与分辨率成反比，因此在这一部中比较小的bead比较合适。吸附性的技术，比如离子交换iex和疏水作用hi通常被用在纯化的这前两个步骤

4、，而凝胶过滤则会留到了最后的修饰那一步，用于小体积，高浓度的样品。另外要注意，进行凝胶过滤层析时，样品的体积应该保持在柱床体积的1%到4%。 选择柱料的时候有两个因素要考虑到，针对目的蛋白的选择性和有效性这些可以由洗脱峰的宽度来说明。其中选择性主要是指填料与目的蛋白相互作用以及结合的能力，iex和hi层析方法就是指目标分子与筛分介质之间的相互作用，而gf的选择性依赖于填料的分馏范围（fractionation range）。 柱料的有效性则是指层析介质洗脱样品得到显著层析峰的能力，mitchell表示，“如果你的峰值不集中，比较宽，那么即使是选择性很好，分辨率仍然会被消弱”。bead越大，洗脱

5、峰就越不集中，柱子的有效性就越低。纯化洗脱相近的蛋白需要高效性，高选择性和高效性的结合就会得到高分辨率。 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 凝胶过滤法（gel filtration）也称为排阻层析（exclusion chromatography）、凝胶层析（gel chromatography）或分子筛层析（molecular sieve chromatofraphy），它是在1960年后发展出来的技术。 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，内部具有状筛孔，利用球状凝胶内的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间

6、的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，故在管柱内的停留时间较长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。一般状况下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。 目前常用的凝胶包括3个主要类型： 1. polydextran polydextran的商品名称是sephadex，它几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。sephadex依其吸水量有不同型号，如 g-25、g-75、g-100或是g-200，g 后面的数字为凝胶吸水量

7、再乘以10，以g-25为例，表示1克干燥的g-25凝胶可以吸水2.5 ml。 ge的sephadex g-25柱就是这一系的产品，十分适合于快速处理不同体积的样品，可以用在层析纯化的前、中、后的任一阶段，即适用于实验室操作，也可以在生产上应用。达柱体积30的样品可通过简单的一次性上柱，脱盐并转换道新的缓冲液中，一些不需要的低分子量的物质，如盐分子就被洗脱了，这种产品最大的特点就是高速和高容量，处理起样品来快速高效。 2. polyacrylamide polyacrylamide是一种合成凝胶，商品名bio-gel p，干粉颗粒状，在溶剂中自动溶成胶体，依胶的分离范围不同，分成bio-gel

8、p-2至bio-gel p-300，p后面的数字乘以1000为最大过滤限度。polyacrylamide的化学性质不活泼，但它在极端的ph 下会被水解，水解后产生的cooh-具有离子交换的性质，因此ph 值应尽量控制在2-10之间。 3. agarose 商品名separose，属于天然凝胶，依凝胶中干胶的百分含量，分为sepharose 2b，4b和6b。agarose gel 是一种大孔凝胶，主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质，因其颗粒软，在分离过程有时会阻塞管柱，造成流速减慢，又因其在摄氏50度以上会融化，故需于较低温的环境中进行层析。agarose 做成beads后

9、不能再脱水干燥，所以要在湿态中保存。 凝胶和管柱的选择： 凝胶的材质需为化学惰性，与分离物不能产生变性（denature）或是其它化学反应，最好具有能长期反复使用的稳定性，并可以在较大的ph和温度范围内使用。由于凝胶上的离子交换基团会吸附带电荷的物质，产生离子交换的效果，所以凝胶上最好不具有离子交换的基团。此外，凝胶要有一定的机械强度，在层析过程中才不会变形，增加机械强度也可使层析在较高压力的环境进行，缩短分离时间。 凝胶颗粒的粗细与分离效果有直接关系，颗粒细的分离效果好，但流速慢而费时，因此要依据实际的需要来选择。对于分子量较小的物质，一般采用polydextran或polyacrylami

10、de材质的凝胶，大分子物质则使用agarose。 以sephadex为例，sephadex g-50可用于区分分子量1,50030,000之分子，而sephadex g-75 凝胶可区分分子量3,00070,000之分子，所以若要分离分子量10,000及20,000之分子，两种都适用。 如果要分离的分子大小相差很多，则可选用柱高：直径5：115：1的管柱，且管柱体积要大于415倍的样品体积；如果要分离的物质之间分子量差异不大，则要选用柱高：直径20：1100：1的管柱，且管柱体积要大于25100倍的样品体积。 凝胶的处理： 商品凝胶一般是干燥的颗粒，使用前要先泡在欲使用的冲洗液中，使它充份膨胀

11、，否则有引起凝胶柱破裂的危险。热胀法是常用的前处理法，即把浸于冲洗液中的凝胶加热，让它膨胀并除去气泡，温度够高的话（加温至近沸腾）也可消毒杀菌。凝胶处理过程不能剧烈搅拌，如此易使颗粒破裂，影响流速。 将凝胶装入管柱的方法有很多种，实验室常用的方法是先在柱中加入约1/3 体积的冲洗液，边轻轻搅伴边将凝胶悬浮液倒入其中，等到底部沉积约12公分的凝胶后，打开下方出口让水流出，上面不断加入悬浮液，等到沉积到离顶部约35公分处停止，让35倍柱床体 积的缓冲液流过层析柱。若用polydextran的凝胶，可放入有颜色的蛋白质（如cytochrome c）流过管柱，看看色带是否均匀下降，不均匀或出现气泡，凝胶均需倒出重新填装。 冲洗缓冲液仅需留高于柱床2 公分左右，多余的可用滴管吸去，再将出口打开使冲洗液流到距表面12公厘，关闭出口，用滴管缓缓加入样品再打开出口，样品完全渗入凝胶内后，加入约4公分冲洗液，出口处接上收集瓶开始层析。 由于polydextran 和agarose都属于多醣类，一旦微生物生长过多，分泌的酶会水解凝胶使其性质改变，为了防止这种情况发生，凝胶最好采用真空或低温保存，但温度不能过低使凝胶冻结。加入抑菌剂（chlohexidine, chlorbutol,