第十三章 免疫细胞分离及表面标志检测

1、,第十三章 免疫细胞的分离及免疫细胞功能检测及应用,2,免疫细胞的分离及检测,检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定 方法：体外法为主 目的：判断机体免疫状态 意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效,免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的细胞从血液或 组织中分离出来,第一节 免疫细胞的分离,外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T细胞和B细胞的分离 T细胞亚群的分离,细胞分离基本原理,不同细胞密度不同 不同细胞生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同,一、外周血单个核细胞分离,外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）包括淋巴

2、细胞和单核细胞（monocyte）。,聚蔗糖-泛影葡胺,聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒,原理：外周血中各细胞的比重不同，PBMC的比重为1.0751.090，红细胞和多核细胞分别为1.093和1.092，选择比重为1.0770.001的介质，细胞与介质混合后离心，比重比介质大的红细胞和多核细胞沉降在下层，而PBMC位于 Ficoll分离液上层。,用1.0770.001的分层液可分离人外周血单个核细胞,(聚蔗糖-泛影葡胺）,对分离介质的要求：对细胞无毒； 等渗； 与血浆和分离细胞不相溶； 有特定的比重。,不同动物的PBMC比重有差异：小鼠：1.085 大鼠：1.087 人： 1.0751.090,

3、方法学评价：分离得到的PBMC纯度可达， 淋巴细胞占； 操作简便； 易于无菌。,二 、淋巴细胞分离,贴壁粘附法 吸附柱过滤法 Percoll 分离液法 （连续密度梯度离心）,利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平培养瓶，37温箱静置1 h，单核细胞将贴附于平皿壁上，而未贴壁的细胞几乎全为纯淋巴细胞。 橡皮棒刮下贴壁的细胞，可得纯单核细胞(无活性）。,1.贴壁黏附法,注意：B细胞也可粘附,利用单核细胞具有贴壁生长的特点，将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶Sephadex G10的层析柱中，凡有黏附能力的细胞绝大部分被吸附而黏滞在柱层中，从柱上洗

4、脱下来的细胞主要是淋巴细胞。,2. 吸附柱过滤法,PBMC,洗 脱,洗脱液 淋巴细胞,单核细胞 DC B细胞 T细胞,细胞的粘附能力：,3. Percoll 分离液法,Percoll 是一种经聚乙烯吡咯烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。采用预先形成的密度梯度，分离的细胞轻轻叠加到液面上Percoll 液经离心后可形成一个从管底到液面逐渐递减的连续的密度梯度，不同密度的细胞将悬浮于各自不同的密度区带，从而将密度不等的细胞分离纯化。,三、T、B细胞和T细胞亚群的分离,磁性微球分离法 荧光激活细胞分离仪分离法,1. 磁性微球分离法,磁性微球：金属小颗粒（Fe2o3, Fe3o4)，其表面包

5、裹有高分子材料（聚苯乙烯，聚氯乙烯等），表面有活性基团（氨基、羧基和羟基），可结合生物大分子物质（抗原，抗体，核酸等）。 免疫磁珠：微球表面包被有免疫物质称免疫磁珠。,流式细胞分析仪,2 .荧光激活细胞分离仪分离法,E花环沉降法 尼龙毛柱分离法,T细胞和B细胞的分离,1. E花环沉降法（E受体/CD2与绵羊红细胞结合）,2. 尼龙毛柱分离法,此法简便快速，不需特殊仪器，淋巴细胞活性不受影响，T细胞纯度可达90%以上。,四、不同细胞分离方法的综合评价,早期,细胞物理属性,细胞生物属性,分辨率和灵敏度不高,现在（根据细胞表面标志）,分辨率和灵敏度高,缺点：不适用于细胞表面分子不清的细胞分离，试剂和

6、仪器昂贵,五、分离细胞的保存和活力检测,1.分离细胞的保存 对保存液的要求：等渗，具pH 缓冲作用，并对细胞无毒性（Hanks、Tc-199、RPMI 1640 ）。如需短期保存，置4放置较好，可减低细胞代谢活动。如需长期保存，应放入液氮罐中在深低温(-196)条件下保存细胞。,2 .细胞活力测定 细胞活力常用活细胞占总细胞的百分比表示，细胞活力的测定常用的简便方法是台盼蓝(trypan blue)染色法。死细胞着色，染成蓝色；活细胞拒染。,用血细胞计数器在显微镜下观察到着色和不着色的细胞，计数200 个细胞，以不着色细胞的百分率即代表细胞的活力。,一、T细胞表面标志的检测,二、B细胞表面标志

7、的检测,四、细胞表面标志检测的意义,三、自然杀伤细胞表面标志的检测,第二节 淋巴细胞标志及亚群分类,一、T细胞表面标志及其亚群,CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞 （help T cell,Th） CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL） CD4+CD25+调节性T细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg）,二、B细胞表面标志,SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。 CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。,二、B细胞表面标志,三、NK细胞表面标志,人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为NK细胞。,淋巴细胞表面标志检测的临床意义,淋