藻胆蛋白的生物合成及光谱分析 - 图文

1、藻胆蛋白的生物合成及光谱分析 - 图文 藻胆蛋白的生物合成及光谱分析 作者：邱容 朱焱 谢雪林 作者单位：湖北师范学院生命科学学院0803班（邱容、朱焱） 湖北师范学院生命科学学院0801班（谢雪林） 摘要: 藻胆蛋白是红藻、蓝绿藻、隐藻中的捕光色素蛋白，主要成分为藻红蛋白(phycoerythrin,pe)，藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin,pec),藻蓝蛋白(phycocyanin,pc)和别藻蓝蛋白(allophyxoxyanin,apc)。本实验只是进行藻蓝蛋白的生物合成及光谱分析，通过将载有藻蓝蛋白基因的质粒导入e.coli中，从而构建能合成藻蓝蛋白的工程菌,通过对工

2、程菌的扩大培养，诱导表达，进而从工程菌中通过亲和层析法提取所需的藻蓝蛋白。提取的藻蓝蛋白通过紫外可见光谱仪进行光谱分析。 关键词：藻蓝蛋白 生物合成 光谱分析 abstract: phycobilin , a kind of protein which can catch light ,exist in red algae, blue-green algae, cryptomonad.it consists of phycoerythrin(pe),phycoerythrocyanin(pec),phycocyanin (pc) and allophyxoxyanin (apc). this

3、report presents the biosynthesis and spectral analysis of the pc, by sending the plasmids carrying the gene which can produce pc into e.coli, thus creating the engineering bacterium which can procuce pc.through the expanding culture ,induction and the affinity chromatography，we can extract pc from t

4、he engeneering bacterium to obtain pc . extraction of pc can be spectral analysed by uv-visible spectrometer. key words：phycobilin biosynthesis spectral analysis 藻胆蛋白是一种水溶性色素蛋白，存在于红藻、蓝藻、隐藻和某些甲藻体内，是这些藻类特有的光合系统捕光色素，在光合作用中起捕集光能和传递能量的作用，根据结构和光谱特性可将藻胆蛋白分为藻红蛋白、藻蓝蛋白和别构藻蓝蛋白。藻胆蛋白具有性质稳定，荧光量子产量高，背景干扰小，易于同生物素、抗

5、体和糖蛋白等大分子交联等特点，既可以作为天然色素广泛应用于食品、化妆品、染料等工业，又可制成荧光试剂，用于临床医学诊断、免疫化学及生物工程等领域，还可以作为光动力治疗癌症。本实验只是进行藻蓝蛋白的生物合成及光谱分析，通过将载有藻蓝蛋白基因的质粒导入e.coli中，从而构建能合成藻蓝蛋白的工程菌,通过对工程菌的扩大培养，诱导表达，进而从工程菌中通过亲和层析法提取所需的藻蓝蛋白。提取的藻蓝蛋白通过紫外可见光谱仪进行光谱分析。 1、材料与方法 1.1材料： 菌种（已导入藻蓝蛋白基因的工程菌） lb培养基 卡那霉素 氯霉素 异丙基硫代-?-d-半乳糖苷（isoprophyl thio-?-d-gala

6、ctoside，简称iptg） 超声缓冲液（ 0.5mol/l nacl、20mmol/l磷酸钾缓冲液（kpp），ph7.2） 0.5mol/l 氯化镍 柱平衡液 洗脱液（0.5mol/l nacl、20mmol/l磷酸钾缓冲液，ph7.2）， 洗脱液（50mmol/l咪唑、0.5mol/l nacl、50mmol/l 磷酸钾缓冲液(ph7.2)）， 透析液（50mmol/l kpp,0.5mol/l nacl，ph7.2） 1.2方法： 1.2.1、菌种的活化 配臵lb培养基1l（蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，20min。）(7.20 、14:00) 取10ul的保存大肠杆菌接

7、种于5ml的lb培养基中，添加抗生素（卡纳霉素12ul、氯霉素6ul），37摇床培养过夜。（7.20 、19:00） 将试管中活化的1 ml菌液接种到100 ml lb培养基，同时加入抗生素（卡纳霉素240ul、氯霉素120ul），培养基于37摇床振荡培养6小时。（7.21 、8：00） 1.2.2、诱导藻蓝蛋白的生物合成 扩大培养的10 ml菌液接种到250ml lb培养基，同时加入抗生素（卡纳霉素600ul、氯霉素300ul），培养基于37摇床振荡培养。 培养至od600约为0.5-0.6，10水浴中放臵1 hr。（7.21 、14:00） 加入iptg至终浓度为1mmol/l。 20低温

8、、避光、过夜诱导，摇床转速为100r/min。（7.21 、19:00） 离心（4000rpm,5min）收集细胞，二次蒸馏水洗两次。（7.22 、 9:30） 1.2.3、藻蓝蛋白的提取与纯化 将洗好的细胞重悬于一定量的超声缓冲液中，用超声波细胞粉碎仪进行超声破碎细胞5 min，于12000g离心15 min。（7.22 、11:00） 亲和层析法提纯蛋白质溶液：取上清加到用柱平衡液预平衡好的ni亲和层析柱上，用柱平衡液洗柱三次，采用洗脱液洗脱杂蛋白，采用洗脱液收集色素蛋白。（7.22 、14:00） 洗脱产物装入透析袋中，用透析液透析三次，每4小时换一次析液以去除咪唑。 1.2.4、藻蓝蛋白的光谱分析 吸收光谱用紫外可见光谱仪，紫外可见光谱扫描范围300800nm，扫描速度960nm/min，狭缝宽度1.0nm 2、实验结果 2.1、工程菌经诱导经两次离心后的照片如下， 第一次离心 第二次离心 由以上两张图片我们可以看到细胞沉淀物呈蓝绿色。