菠萝蛋白酶提取

1、菠萝蛋白酶提取 菠萝蛋白酶提取 一 实验目的: 1.了解菠萝蛋白酶的基本性质，设计提取方法并测性其蛋白总量及酶活性； 2.计算从菠萝中提取菠萝蛋白酶时每步的回收率，判断提取方法的优劣。 二实验原理： 菠萝蛋白酶外观为白色至浅棕黄色无定形粉末；可溶于水，水溶液无色至淡黄色，有时有乳白光，不溶于乙醇、氯仿和乙醚；属糖蛋白。主要作用原理是使多肽类水解为低分子量的肽类，尚有水解酰胺基键和酯类的作用。其作为一种食品添加剂可用于肉质嫩化,啤酒澄清,还用于干酪、明胶及水解蛋白的生产。 在医药上它可以治疗水肿及多种炎症；它能迅速溶痂,对正常组织无害,不影响植皮,适用于中小面积深度烧伤的治疗。 提取菠萝蛋白酶的

2、传统工艺是高岭土吸附法和单宁沉淀法。 高岭土吸附法生产工艺和操作都比较复杂,原材料消耗多,所需设备也多,酶活总回收率低,但产品质量较好,纯度较高,单宁沉淀法工艺和操作比高岭土法简单,原材料消耗少,所需设备少,但酶活回收率低。 有些研究用超滤法对传统工艺进行了改革,不仅使菠萝蛋白酶产品更纯,而且酶粉得率比传统工艺高,但超滤法生产工艺和和操作比上述两种方法复杂,工人素质要求高,且设备一次性投资大。 本实验采用新型吸附法提取菠萝蛋白酶,步骤简单,产率比传统方法有所提高,是一种有发展的方法。在新型吸附沉淀法提取菠萝蛋白酶中,所使用的锌离子对酶有激活作用,乙二胺四乙酸是一种螯合物,可有效地螯合原料中某些

3、重金属离子,以避免其与酶结合而使酶失去活性,抗坏血酸则具有还原性,分子上的活泼羟基氢可使酶活性中心保持还原状态,从而有效地保持酶活性,其中以edta 和l2半胱氨酸组合,效果最佳。 单宁用量多少会直接影响酶产量,一般范围0. 15 %0. 25 %的浓度。 采用folin-酚法测定蛋白酶含量，发生双缩脲反应的蛋白中酚基（酪氨酸），在碱性条件下将磷钼酸和磷钨酸还原成钼酸和钨酸，呈蓝色，在650nm和66onm处有最大吸收值。folin-酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠 （knac4h4o6?4h2o）组成。多肽中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作

4、用，生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸、磷钨酸、硫酸和溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被多肽中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与多肽含量成正比。 活性测定方法是以酪蛋白水解释放的氨基酸在275nm的吸收值为基础。酶活单位定义为在37 ，ph7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白所产生的酪氨酸的微克数为一个菠萝蛋白酶单位。ph 值对酶活力有很大的影响,大多数的酶在酸性条件下活力最强,最适合菠萝蛋白酶的ph 为7. 4 ,在碱性条件下就会失活,在操作过程中应注意ph 值的变化。 从温度2酶活力曲线上可以看出,温度也是影响酶活力的重要因素之一,最适合的温度为45 。 三实验步骤： （1）新型吸附法提

5、取菠萝蛋白酶的过程： 菠萝压榨得汁液, 按压出汁液的体积量加10 %氯化钠,在室温下自然沉降120 h ,弃去沉淀物,得澄清液。 将澄清液移入烧杯中,在搅拌条件下,按澄清液体积加入0. 05 ta22na 、0. 02 %维生素c ,立刻加入0. 1 %的单宁和自制的吸附剂,在4 下静置1 h ,离心弃去上清液,收集沉淀物,加入23 倍ph 值为4. 5 的抗坏血酸溶液,静l 立即摇匀,在30 保温(或室温下放置) 30 min。 然后,在721 型分光光度计上进行比色测定。 以光密度(o.d. )为纵坐标,以牛血清溶液浓度为横坐标,绘制出牛血清的标准曲线。 未知的菠萝蛋白酶的蛋白质含量在曲线中得到。 （3）菠萝蛋白酶活力测得的实验过程： 分别取酶制品0. 15 g 克加入ph7. 0 , 0. 05mol/ l 磷酸缓冲溶液定容至100 ml ,过滤,此滤液为溶液酶制剂。 取1 ml 溶液酶加入0. 9 ml 激活剂(ph7. 0 , 0. 05 mol/ l 磷酸缓冲溶液, 内含15mmol/ l 硫代硫酸钠及6 mmol/ l edta22na) ,于37 水浴中保温恒定后,加入同样预热的1