基因工程的基本程序丁.ppt

1、,基因工程的概念,DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,剪切, 拼接, 导入, 表达,获得符合人们需要的新产品,对基因进行操作的“手术刀”、 “缝合针”、 “运输工具” 分别是什么物质？有何作用？,基因工程的剪切、拼接、导入、表达的具体过程是怎么样的呢？,基因工程的基本操作程序（一）,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,剪切： 拼接： 导入： 表达：,一、目的基因的获取,目的基因： 主要指编码蛋白质的结构基因.,例如： 苏云金杆菌抗虫基因 人胰岛素基因 种子贮藏蛋白基因 植物抗病基因,什么是目的基因

2、？,目的基因的来源？,1、从自然界中已有的物种中分离 2、人工方法合成,获取目的基因的常用方法：,1、从基因文库中获取目的基因 2、利用PCR技术扩增目的基因,获取目的基因的常用方法：,1、从基因文库中获取目的基因,什么是基因文库？,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,为什么要构建基因文库？ 直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？,提示：如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的

3、基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。,基因文库种类,基因组文库： 含有某种生物的全部基因,部分基因文库（如cDNA文库）： 含有某种生物的一部分基因,如何构建基因组文库和部分基因文库呢？,限制酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,1)基因组文库,基因文库,提取某种生物的全部DNA,限制酶切割,一定大小的DNA片段,与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,2)部分基因文库（cDNA文库）,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,某种生物的单链mRNA,反转录酶,互补的单链DNA,DNA聚合酶,双链CDNA片段,与载体连接,导入受体菌种储存,CDN

4、A文库,如何从基因文库中获取所需要的基因？,依据：目的基因的有关信息。,如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。,2、利用PCR技术扩增目的基因 一段已知的目的基因序列,通过2n形式扩增获取大量的目的基因 DNA复制（体外） 碱基互补配对原则 4种脱氧核苷酸 PCR仪 Taq酶（耐热的DNA聚合酶）、引物等,目的： 原理： 原则： 原料： 场所： 条件：,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-60）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（

5、70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口 形成两个黏性末端 或平末端,两个切口 获得含有相同黏性末端的目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,二.基因表达载体的构建,(一)过程:,科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因

6、的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资 料:,作为基因表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,基因表达载体的组成：,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,阅读与思考：,启动子、终止子有何作用？ 标记基因有什么作用？,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录 标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基

7、因的细胞筛选出来,启动子与起始密码子？终止子与终止密码子？,启动子和终止子：DNA上 启动子：驱动转录 终止子：终止转录 起始密码子和终止密码子：mRNA上 起始密码子：驱动翻译 终止密码子：终止翻译,阅读与思考：,基因的运载体、目的基因、启动子、终止子等都是DNA片断，如何将它们连接起来？,载体与表达载体的区别？ 二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 用到的工具酶？ 既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键,三将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,动植物细胞、大肠杆菌

8、、土壤农杆菌、枯草杆菌等。,将目的基因导入受体细胞的原理？,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,转化,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法 农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,目的基因,Ti质粒的T-DNA,重组,构建表达载体,转入,农杆菌,导入,植物细胞,a、d指的是什么过程？,农杆菌转化法示意图,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面

9、的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（3）花粉管通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,2、将目的基因导入动物细胞 方法：显微注射法 程序：,(目的基因)表达载体 取卵（受精卵） 显微注射 新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞 原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 方法：,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,思考与探究：,利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素

10、，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,深度思考： 如何筛选出被重组质粒侵入的受体细胞。,青霉素培养基,青霉素抗性基因,思考： 1、受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？ 2、目的基因是否稳定的存在于转基因生物并按人们的预期进行表达，需要在那些水平上进行检测？,四：目的基因的检测与表达,分子水平 检测,检测转基因生物染

11、色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法,方法,方法,DNA分子杂交技术,分子杂交技术,抗原-抗体杂交技术,1、提取受体生物DNA，并解旋成单链； 2、用标记了放射性同位素的目的DNA片段单链作为探针； 3、检测两者是否进行杂交；,A-,A-,T-,T-,C-,G-,T-,探针,待测DNAX,待测DNAY,待测DNAY与探针DNA相同,分子水平 检测,个体 水平鉴定,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,

12、DNA分子杂交,mRNA-DNA 分子杂交,抗原-抗体杂交,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,尝试设计,1）获取小鼠-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。 2）将cDNA、在大肠杆菌中可以适用的启动子、终止子、抗四环素的基因、质粒等，构建成一个表达载体。 3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌