发酵工程原理与技术第二章.ppt

1、第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术,第一节 发酵工业微生物菌种的选育,微生物的特性及工业微生物的要求 发酵工业微生物菌种的分离和选育 发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏,有些微生物能在厌氧的条件下生长,有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长,有些微生物能进行复杂的代谢,有些微生物能利用较复杂的化合物,有些微生物能在极端的环境下生长,微生物的特性及工业微生物的要求,微生物的特性,利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物,有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强,遗传性能要相对稳定不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素,产生菌及其产

2、物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）,工业化菌种的要求,微生物的特性及工业微生物的要求,培养条件易于控制,生长迅速，发酵周期短,发酵过程产生的泡沫少,不易感染它种微生物或噬菌体,对需要添加的前体物质有耐受力，并不能将前体物质作为一般的碳源用。,工业化菌种的要求,微生物的特性及工业微生物的要求,工业生产常用的微生物,细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。 酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。,工业生产常用的微生物,霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种酶制剂、

3、抗生素、有机酸及甾体激素等。 放线菌（actionmycetes）：原核微生物类群。在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较为广泛。主要用于生产多种抗生素,工业生产常用的微生物,担子菌（basidiomycetes）：主要用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发。 藻类（alga）：许多国家已把它作为人类保健食品和饲料。还可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻类农场”获得氢能的报道。,发酵工业微生物菌种的分离和选育,微生物菌种的分离 微生物菌种的选育,微生物菌种的分离,施加选择性压力分离法 随机分离方法,施加选择压力的分离方法,富集培养 供给特殊培养基或加入某些抑制剂。 培养方法 分批式富集培养,连

4、续富集培养 固体培养基,分批式富集培养（摇瓶培养） 重复移植几次后，接种已富集的培养物到固体培养基，可将优势微生物分离出来。 移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。,施加选择压力的分离方法,连续富集培养： 用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。 改变限制性基质浓度可以控制两种菌的比生长速率。,连续富集培养法可以筛选出能共生的稳定混合培养物，例如用甲烷作碳源筛选到甲烷营养型和一些非甲烷营养型的共生菌。,施加选择压力的分离方法,固体培养基的使用 常用于分离酶产生菌，选择培养基中常含有所需的基质，以便促使酶产生菌的生长。 举例：产碱性蛋白酶的菌的分离。碱性土壤铺在pH910的琼脂培养基(含有均匀的不

5、溶性蛋白质)表面。根据蛋白质水解圈的大小判断蛋白酶的产生能力。,施加选择压力的分离方法,有些微生物的产物对筛选没有任何选择性优势。因此常需随机地分离。,随机分离方法,筛选！,生长因子产生菌的筛选 核苷酸等生长因子的生产不能作为分离步骤中的选择压力，可用随机办法分离产生菌，并通过筛选试验检出产生菌。 例如：通过观察分离株能否促进营养缺陷型的生长，便可检出生长因子产生菌。,随机分离方法-筛选,抗生素产生菌筛选 在含有敏感菌的平板上鉴定抗生作用。也可在液体培养基中，检测抗菌活性。,随机分离方法-筛选,药理活性化合物的筛选 酶靶法： 基本原理：一种化合物如在体外具有抑制代谢过程的某一关键酶的作用，它在

6、体内一般也具有相应的药理作用。 若将体外筛选出的活性化合物，再用动物做实验，可筛选出新的药理活性化合物。,随机分离方法-筛选,随机分离方法-筛选,多糖产生菌的筛选 制糖工业污水中可能含有很多这种菌种。 可从菌落的黏液状外观识别这类产生菌。,随机分离方法-筛选,生物进化过程中野生型微生物形成完善的代谢调节机制,不会有代谢产物的积累,解除或突破微生物的代谢调节控制,目的产物积累,微生物育种的目的,方法：突变、体内重组 体外重组（基因工程）,微生物菌种的选育,经典育种：自然选育和诱变育种 定向育种：转化、转导、接合、原生质体融合、代谢调控和基因工程等。,微生物菌种的选育,自然选育：利用菌种自然突变(

7、Spontaneous Mutation)进行菌种筛选的过程。 自然突变：微生物在没有人工参与下所发生的突变。 引起自然突变两个原因：多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。,自然选育,前 进,多因素低剂量诱变效应：自然突变实质上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，如宇宙空间各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物质(如H2O2)的作用等。,自然突变,互变异构效应：五种碱基第六位上的酮基和氨基， G 和T可以酮式或烯醇式出现， A 和C可以氨基或亚氨基形式出现。,自然突变,腺嘌呤(adenine, A),鸟嘌呤(guanine,

8、 G),胞嘧啶(cytosine, C),尿嘧啶(uracil, U),胸腺嘧啶(thymine, T),嘌呤(purine),腺嘌呤(adenine, A),鸟嘌呤(guanine, G),嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine, C),尿嘧啶(uracil, U),胸腺嘧啶(thymine, T),五种碱基都能形成酮式-烯醇式或氨基-亚氨基的互变异构。这两种异构体的平衡关系受介质酸碱环境的影响。,互变异构效应,互变异构效应,平衡倾向于酮式和氨基时，DNA双链中以AT和GC碱基对为主。 T以烯醇式出现，在DNA复制到达该点的一瞬间，与G配对； C以亚氨基出现时，在新合成的DN

9、A单链的C点出现A 碱基对发生自然突变几率约10-810-9。,结果： 1、菌种衰退和生产质量下降； 2、对生产有益的突变。 为此，菌株应定期纯化，保存优良菌种(复壮)。 实际生产中，从高产批号中取样分离单菌落，从中选 出稳定菌株用于生产。,自然突变,自然选育,自然选育的优越性:简单易行,可以达到纯化菌种,防止菌种衰退,稳定生产,提高产量的目的. 缺点:效率低,进展慢,很难使生产水平大幅度提高.,自然选育程序： 把菌种制备成单孢子悬液，适当稀释，在平板上分离，挑取单菌落进行生产能力测定，经反复筛选，以确定生产能力更高的菌株。,自然选育,诱变育种理论基础：基因突变。,诱变育种,自然突变：自然条件

10、下出现的基因突变。 诱发突变：用各种物理和生物因素、化学因素人工诱发的基因突变。 诱变剂处理使菌种发生突变频率和变异幅度提高获得特性优良变异菌株的几率高。,诱变育种主要步骤,出发菌株的诱变处理 和 突变体的筛选。,前进,出发菌株诱变处理,包括： 出发菌株的选择 诱变剂的选择 诱变剂量和处理时间的确定,返 回,（1）出发菌株 出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。,几个应注意的问题,（2）复合诱变因素的使用 野生型菌株用单一诱变因素有时能取得好效果；老菌种单一诱变因素重复使用突变效果不高，可利用复合因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。 青霉菌选育：先以氮芥处理很短时间而不引起突变，再用U

11、V处理，可使诱变频率大为提高。提高突变频率可获得高产菌株。,几个应注意的问题,乙烯亚胺和UV复合处理，氯化锂和UV复合处理，都用得较普遍，且有一定成效。 氯化锂本身无诱变作用，与一些诱变因子一起使用时能促进突变。,几个应注意的问题,（3）剂量选择,变异率取决于诱变剂量，变异率和致死率之间有一定关系。用致死率作为选择适宜剂量的依据。 合适剂量：同时增加变异幅度与正突变。,几个应注意的问题,绝大部分个体死亡 少数存活 多数未变 少数突变 多数负变 少数正变 多数幅度小 少数幅度大 多数不宜投产 少数适宜投产 存活率 突变率 正变率 高产率 投产率,（4）变异菌株的筛选 诱变目的：高产菌株、新产物。

12、,几个应注意的问题,突变体的筛选,一般经初筛和复筛 初筛：一般定性，更多的是通过平板采用变色圈、透明圈、 抑制圈、生长圈或沉淀圈等方法测定某变异特性的 存在，粗略推算出产量，有时也用液体培养。 复筛：对初筛结果的菌株生产性能作比较精确的定量测定 还需通过小型和中型发酵投产试验才能用于生产,例子,前进,1,2,3,1,1,2,3,初筛,对照(HC0 =HC1+ HC2 + HC3),( HC1 HC0能力增强) ( HC2 HC0能力减弱) ( HC3= HC0能力不变),诱变,1,1,2,3,3,对照(HC0 =HC1+ HC2 + HC3),( HC1 HC0能力增强) ( HC2 HC0能

13、力减弱) ( HC3= HC0能力不变),诱变,1,2,3,3,诱变后的突变株会继续变异，低单位菌株在传代过程中往往占优势，因此复筛中常常出现产量高低不稳的状态，必须进行自然分离诱变育种和杂交育种必须环节。 自然选育和诱变育种交替使用可获高产菌株。,饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片变色圈,指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液,固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。,利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物 能力，工具菌就能围绕该菌生长,待筛选的菌

14、株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质,营养缺陷型突变株,抗阻遏和抗反馈突变型,特殊变异菌的筛选方法,组成型突变株,抗（敏感）性突变株,高丝氨酸缺陷菌生产赖氨酸,必需氨基酸 食品、医药、畜牧业需要量很大 但在代谢过程中，一方面赖氨酸对天冬氨酸激酶有反馈抑制，另一方面还同时生成苏氨酸和甲硫氨酸，使赖氨酸不能在细胞内累积 高丝氨酸缺陷菌（不能合成高丝氨酸脱氢酶，补充适量高丝氨酸）则合成大量赖氨酸,天冬氨酸,天冬氨酸 磷酸,天冬氨酸 半醛,高丝氨酸,苏氨酸,甲硫 氨酸,赖氨酸,AK,HSDH,C.glutamicum的代谢调节与赖氨酸生产,AK：天冬氨酸激酶 HSDH：高丝氨酸脱氢酶,营养缺陷型的筛

15、选,淘汰野生型 检出缺陷型 鉴定缺陷型,前 进,淘汰野生型,原因： 营养缺陷型的比率很低，只有百分 之几到千分之几，淘汰为数众多的 野生型菌株，可达到“浓缩” 营养缺 陷型的目的 方法：抗生素法或菌丝过滤法,返 回,抗生素法,原理：抗生素只杀死生长中的细菌或真菌，在基本培养基上加抗生素，将野生型细菌杀死，营养缺陷型不死，从而来浓缩营养缺陷型,细菌 通常 青霉素 （抑制细胞壁的合成） 真菌 制霉菌素 （破坏真菌细胞膜）,返 回,菌丝过滤法,原理：在基本培养基上野生型发育成菌丝而营养缺陷 型不能，培养一段时间后，用擦镜纸等合适滤 纸过滤，重复多次过滤除去大部分野生型个体。,条件：丝状真菌和放线菌,

16、返 回,检出缺陷型,A夹层培养法 B逐个检出法 C影印培养法,返 回,夹层培养法,方法：先倒一薄层不含菌MM，冷凝后加上一层混有经过诱变处理的菌液的MM，再浇一薄层不含菌MM，“三明治”，培养长出菌即野生型，在皿底做上记号，再倒第四层CM培养，野生型继续繁殖，菌落变大，营养缺陷型开始生长，菌落较小,培养皿侧面,培养皿正面（新、小菌落即营养缺陷型）,返 回,逐个检出法,依次挑取菌落依次接种在MM和CM培养比较，在完全培养基的某一部位长出菌落而MM不长，则是营养缺陷型,CM MM,CM,营养缺陷型,返 回,影印培养法,完全培养基,影印接种,基本培养基,返 回,影印培养法,返 回,鉴定缺陷型,生长谱

17、法,返 回,生长谱法,方法： 营养缺陷型菌株与MM以一定的浓度混合倒在培养皿上，干燥后，在皿底画上若干区域，然后，在正面加上微量的氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶等营养物的粉末或结晶（滤纸片法也可）。 培养后，如果某一营养物的周围有微生物的生长圈，说明它就是微生物的营养缺陷型。,返 回,诱变,检出营养缺陷型,淘汰野生型,鉴定营养缺陷型,富集培养 （抗生素法） （菌丝过滤法）,夹层培养法 逐个检出法 影印平板法,生长谱法,营养缺陷型突变株的筛选方法,反馈抑制和反馈阻遏,阻遏蛋白,操纵基因,抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株,结构基因突变，使结构酶无结合能力但有催化活性；末端产物的积累 调节基因或操纵基因突变

18、 产生的阻遏蛋白与终产物不能结合或结合，但不发生作用；末端产物的积累,抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株筛选,方法： 末端产物结构类似物筛选； 未突变者死， 突变为抗者生并产菌落 营养缺陷型回复突变株筛选。 活性复，结构改变,组成酶和诱导酶,组成酶 微生物有些酶总是适量地存在,它们是不依赖 于酶底物或底物的结构类似物的存在而合成的酶,如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶。 诱导酶 适应性酶,是依赖于某种底物或底物的结构类似物的存在而合成的酶。,大肠杆菌乳糖操纵子,i基因,P,O,Lac Z,Lac Y,lac A,有乳糖时,调节蛋白亚基,调节蛋白 阻遏蛋白,RNA聚合酶,i基因,P,O,Lac Z,L

19、ac Y,lac A,诱导物乳糖,无活性的,阻遏蛋白,转录,翻译,-半乳糖苷酶,-半乳糖苷通透酶,-半乳糖苷乙酰转移酶,mRNA,没有乳糖时,诱导酶弊端,诱导酶的生产需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。诱导物有时又比较昂贵。 能迅速利用的碳源（如葡萄糖）会引起酶合成的减少.,生产成本提高,组成型突变株,突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。 少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种突变株称为超产突变株。,前 进,i基因,P,O,Lac Z,Lac Y,lac A,有乳糖时,调节蛋白亚基,调节蛋白 阻遏蛋白,RNA聚合酶,i

20、基因,P,O,Lac Z,Lac Y,lac A,诱导物乳糖,无活性的,阻遏蛋白,转录,翻译,-半乳糖苷酶,-半乳糖苷通透酶,-半乳糖苷乙酰转移酶,mRNA,没有乳糖时,筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。 加诱导酶合成抑制物 交替培养法 显色反应法,组成型突变株筛选,组成型突变株筛选,加诱导酶合成抑制物 如：加邻硝基-D-岩藻糖苷，抑制-半乳糖苷酶合成。 诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利用乳糖，生长，被富集。,组成型突变株筛选,交替培养法 含诱导物（乳糖）中培养组成型快不含诱导物（葡萄糖）中培养诱导型失酶反复。,组成型突变株筛选,显色反应法 不含诱导物平板培养加底物

21、分解（有颜色变化）检出。 如:邻-硝基苯酚半乳糖苷(ONPG)可被-半乳糖苷酶水解为半乳糖和黄色的邻-硝基苯酚（ONP）,抗（敏感）性突变株筛选,包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体 抗生素抗性突变：提高产量； 抗噬菌体突变：消除噬菌体污染； 条件抗性突变：如温度，可提高产量； （温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型）,抗（敏感）性突变株筛选,敏感突变： 如：柠檬酸-异柠檬酸 氟乙酸抑制顺乌头酸酶 氟乙酸敏感突变型 顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量 少，柠檬酸积累。,顺乌头酸酶,抗性突变菌株的筛选,抗生素抗性突变株,在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗性突变可提高抗生素产量。,抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，还能提高其它代谢产物的量。,条件抗性突变,因环境不同，能表现为野生型菌株的特性