大肠杆菌表面展示体系磷酸盐吸附能力的初步研究.doc

1、-范文最新推荐- 大肠杆菌表面展示体系磷酸盐吸附能力的初步研究 摘要：微生物细胞表面工程是近年来发展起来的，它利用细胞表面展示技术使外源蛋白固定化于细胞表面，从而生产微生物细胞表面蛋白。微生物细胞表面工程可用于细胞催化剂、细胞吸附剂、活疫苗、生物传感器的开发等。微生物细胞表面工程具有广阔的应用前景，但是国内对这一领域的研究尚刚起步。本课题以展示磷酸盐吸附蛋白的大肠杆菌重组菌为研究对象，优化其培养和测定条件，并测定其磷酸盐吸附能力。结果显示，与受体菌大肠杆菌JM109相比，重组菌具有明显的磷酸盐吸附能力。该结果为将重组菌进一步应用于除磷领域奠定了基础。6190关键词：细胞表面展示；正磷酸盐；吸附

2、；污水处理A preliminary study about the phosphate adsorption capacity of E. coli surface display systemAbstract：In recent years, microbial cell-surface engineering，which uses the microbial cell surface display technology to display foreign proteins on the microbial cell surface，was developed. Cell-surfac

3、e engineering can be used on cell-catalyst，cell-adsorbent，live vaccine，biosensor and so on，and have a wide application perspectiveHowever, in our country，the microbial cell-surface engineering is still a new research field. In our research, a recombinant Escherichia coli, which displayed phosphate b

4、inding protein (PBP) on the cell surface, was used to optimize the cultural and determination conditions. The phosphate binding ability of recombinant strain was further determined by the optimized conditions. The results indicated that recombinant strain showed high efficiency of phosphate binding

5、ability. These results demonstrated that PBP cell surface display system gained significant applications in phosphate removal.Key words: Cell surface display; orthophospha; adsorption; sewage treatment.目 录1前言6 参考文献261前言1.2 有机磷水解酶的大肠杆菌细胞表面展示PCR扩增来自黄杆菌ATCC27551的有机磷水解酶基因opd ，直接用Xon I酶切与pZXL-T连接，将opd克隆于

6、锚定单元Lpp-OmpA编码序列下游，转化Ecoli BL21(DE3)经抗性筛选、PCR鉴定和测序证实，成功构建了具有全细胞催化效应的大肠杆菌细胞表面展示工程菌SDS-PAGE结果表明，工程菌能表达产生51KDa的融合蛋白细胞表面展示的有机磷水解酶具有较高全细胞酶活性，用蛋白酶K消化处理重组菌表面蛋白可使其全细胞酶活降低907。全世界每年大约要消耗40万t的农药其中有机磷类农药占到总农药使用量的70%但真正被害虫吸收的量不到使用量的1 8。Richins等研究表明，表面展示OPH的工程菌讲解对硫磷和对氧磷的速度是胞内表达OPH工程菌株的7倍9，而且比纯化的OPH更稳定,活力更强10。通过物理

7、吸附将这种新型的生物催化剂吸附到固定载体上，代替固定化OPH，是一种用于杀虫剂脱毒的有效手段.然而在长期的运行过程中，微生物会逐渐的从载体上脱落，从而降低了固化细胞系统的有效性，利用可逆吸附或特殊吸附手段可以提高其稳定性。近几年，国内的有机磷农药生物降解的研究发展迅速，中国农业科学院生物技术研究所范云六11 等，在有机磷农药降解酶制剂基因工程研究方面也取得了重要进展：南京农业大学的顾立峰等以Pseudomona putida KT2440为宿主菌成功构建高有机磷降解活性的基因工程菌。但是目前OPH表面显示技术还存在一些问题如利用表面显示的OPH 活力相对较低且保持时间短，载体系统的表达效率不高

8、，表面显示系统会出现生长停滞和细胞自溶等现象，大部分研究尚停留在实验室阶段。此外，OPH水解有机磷化合物生成的对硝基酚(Pnitrophenol，PNP)仍是一种难降解化合物，已被美国EPA定为优先污染物。因此，要实现有机磷化合物的完全降解，还必须借助于分离和表达对硝基酚降解基因，这方面还有待科学家们的进一步研究。 1.4.2吸附法除磷吸附法是利用多孔和大比表面积的固体物质，通过磷在吸附剂表面的附着吸附、离子交换或表面沉淀来实现污水的除磷过程。这类吸附剂需具有价格低廉，吸附效率高，性能稳定，抗离子干扰性强，无有害物质溶出，易再生等特点。天然吸附剂主要有粉煤灰、钢渣、沸石、高岭土、膨润土、活性氧

9、化铝等，这些材料中含Fe、Al、Ca和Mg等金属元素氧化物，可作为阳离子絮凝剂有效吸附磷20。天然材料易于得到，成本低廉且废物利用，但吸附容量较低，产物不易处置。人工合成吸附剂的使用弥补了天然吸附剂的不足。目前已有Fe、A1、Mg、Ca、Ti、Zn多种金属氧化物及其盐类作为吸附剂用于除磷技术的研究。该类吸附剂较天然吸附剂吸附容量高得多，即使在较低的磷酸盐浓度下依然具有强吸磷效果。人工合成吸附剂己成为吸附剂领域研究的主要方向。无论是化学除磷还是吸附除磷，磷的去除都是通过将污水中溶解性磷酸盐转化成不溶性固相状态，通过固液分离从污水中将磷分离。但是这一固相形态可能为不溶的金属盐，这些方法回收得到的磷

10、无法循环持续利用，因为它们的回收可能附带着其它无用副产品的回收，有些甚至是有毒的20。1.4.3人工湿地系统人工湿地21是低成本低能耗的环境污染控制体系，它是植物吸收、基质吸附过滤和微生物转化的综合作用。人工湿地从多方面达到对污水的净化作用，可分为表面流湿地、地下潜流湿地和垂直流湿地等类型16,21。人工湿地是一个容器，其中生长有水生或陆生植物等，这些植物尤其是大型水生植物淹没或半淹没的根系对污水有过滤作用。各种污水从一边缓缓流入，水生植物过滤去除有机物，吸收氮、磷等植物营养物质，净化后从另一边流出22。此外，在淹没的植物根系中附着生长了大量的微生物，这些微生物能进一步吸附和降解水中污染物，促

11、进净化效果。人工湿地具有良好的除磷效果。磷的去除是通过植物吸收，微生物吸附及基质材料的过滤等综合作用完成。磷是植物必须的营养元素，污水中的磷被植物吸收而得到有效的循环利用。评估对浮萍的磷吸附能力发现，污水中磷含量下降了52以上21。芦苇，莎草类和茨藻属植物磷吸附量高达90以上。此外，细菌也需要吸收污水中的磷，供自身生长利用。磷在微生物细胞内的累积可通过更换湿地中基质材料而除去。湿地中的基质材料通常含有较多的铁、钙和铝氧化物等容易与磷酸盐发生反应生成难容磷酸盐的物质，从而降低污水中的磷含量16。总之，对各种污水中的含磷物质，人工湿地均可有效去除。当然，这要求针对污水来源的不同，选择合适的植物，基

12、质材料的大小和类型，以及对湿地更好的设计。 1.4.5大肠杆菌磷酸盐吸附蛋白1.4.5.1大肠杆菌磷运输系统磷是细菌细胞生长和代谢不可或缺的重要元素。磷元素的获得主要通过从环境中摄取磷酸盐等含磷物质，运输进入细胞内部达到为细菌细胞自身利用的目的。这一过程中涉及到磷酸盐的吸收运输调控机制以及表达的一系列相关蛋白。磷被大肠杆菌吸收以及在大肠杆菌细胞内的运输主要通过两个系统即“PST系统”(Phosphatespecific transport system)和“PIT系统”(Phosphate inorganic transportsystem)完成

13、。PST系统是由一组典型的细胞周质蛋白质组成。一共4个基因编码的蛋白质参与了该系统的磷酸盐运输过程，它们是phoS、pstA、pstC和pstB。phoS基因编码的磷酸盐结合蛋白是PST系统磷酸盐吸收运输的关键蛋白，在细胞周质空间中结合磷酸盐并转运至细胞质膜。PST系统的转膜部分由pstA和pstC两基因编码的包括6个跨膜a螺旋结构域构成的疏水蛋白质组成。pstB基因编码的亲水性蛋白质包含ATP结合结构域，该蛋白与PstA和或PstC蛋白在细胞内膜的胞质一侧结合。突变实验表明，在PstB提供的ATP能量作用下，PstA和PstC的a螺旋结构域控制磷酸盐通道的开启和闭合，磷酸盐通过PstA和Ps

14、tC中间的3个精氨酸/谷氨酸(或天冬氨酸)盐桥被转移至胞质。PST系统的调控通过phoU基因编码的调控蛋白完成(基因phoS、pstA、pstC、pstB和phoU共同组成的操纵子与其它一些磷饥饿诱导基因组成pho(phosphate)调节子。当磷酸盐充足时，phoS基因的表达处于低水平状态。在环境中磷酸盐有限时，phoR基因表达的整合膜蛋白传感器通过磷酸化作用将phoB蛋白转化成具有活性的形式，phoB蛋白在转录水平上激活pho调节子中各个基因的表达。PST系统在磷酸盐浓度高于lmM时受到抑制，但能抵抗解偶联抑制剂。在PIT系统中，基因pit是主要基因。该系统允许细胞内外磷酸盐的交换，无需磷

15、酸盐结合蛋白，受到解偶联抑制剂的抑制。研究表明，两种系统的磷吸附最大速率基本相同，但PST系统对磷的特异性和亲和能力明显高于PIT系统。 1.5本课题的研究目的和意义随着微生物细胞表面工程近年来的发展，利用细胞表面展示技术可将外源蛋白展示于细胞表面，使外源蛋白充分与环境中底物分子接触，生产一些供人类生活实践应用的生物产品。本课题以展示磷酸盐吸附蛋白的大肠杆菌重组菌为研究对象，优化其培养和测定条件，测定其磷酸盐吸附能力，为进一步研究展示体系的展示效率和应用领域奠定基础。本课题有利于减轻生活中含磷水污染，对人类的健康和对环境的维护都有极大的帮助。2 使用的材料试剂、仪器设备和采取的方法、技术2.1

16、 使用的材料试剂、仪器设备2.1.1 材料试剂质粒：pTrcHis-C-inpN-gfp菌株：E. coli JM109.无机磷培养基：葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4• 7H2O 0.03 g，MnSO4• 4H2O 0.03 g，MgSO4• 7H2O 0.3 g，酵母膏0.4 g，蒸馏水溶解定容至1.0 L，pH 7.0-7.5。2.1.2实验试剂磷酸二氢钾贮备溶液：称取0.7165 g已于105 ºC干燥过的磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于100 mL去离子水中并定容至1.0

17、L。此溶液1.0 mL含0.5 mg PO43-。磷酸二氢钾标准溶液：含0.1 mg/mL PO43-；钼酸钠-硫酸溶液：1%(w/v)钼酸钠，10%(v/v) H2SO4。2.1.3仪器设备表2-1仪器设备图仪器型号生产厂家温度计（0-100）上海第三分析仪器厂试管1.5cm×15cm（×30）上海市第三分析仪器厂漏斗半径4cm（×10）上海市第三分析仪器厂吸管0.20ml（×2）、0.50ml（×4）、1.0ml（×3）、2.0ml（×4）、5.0（×4）上海市第三分析仪器厂恒温水浴锅W201B

18、上海申胜生物科技有限公司 注：等JM109单菌落加入PCR小管后再加Taq酶扩大：PCR反应体系扩大到50μL做2管（1管对照）图2-3 50μL PCR反应体系试剂名反应组对照组10×PCR buffer5.0μL5.0μLphoS12.0μL2.0μLphoS22.0μL2.0μLMg2+3.0μL3.0μLdNTP2.0μL2.0μLTaq1.0μL1.0μL去离子水35μL35μLJM109单菌落加不加注：等JM109单菌落加入PCR小管后再加Taq酶PCR之后取5μL电泳（DL2000 Marker）。2.4磷酸盐吸附试验2.4.1 标准曲线的制作1）准确吸取0，0.5，1，2，3，4 mL磷酸盐标准溶液(1 mL含0.1 mg PO43-)，分别加入到6支50 mL比色管中，用去离子水稀释至10 mL；2）向各比色管中准确加入4 mL钼酸钠-硫酸溶液及1 mL 0.15%硫酸肼溶液（w/v），混匀，放入沸水浴中煮沸10 min，取出，立即流水冷却，用去离子水稀释至刻度，混匀；3）以试剂空白