第十二讲DNA文库的构建ppt课件

1、基因组文库和cDNA文库的构建,1,第一节 基因组文库的构建,1 基因组文库(genomielibrary): 将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。 作用：获得特定基因。,2,2 基因组文库的类型 根据所选用的载体可以分为： 质粒文库 噬菌体文库 黏粒文库 人工染色体文库,3,3 构建基因组文库应满足的条件 3.1 文库的完整性 要包含基因组的完整序列信息，通过产生一系列一定大小、覆盖全基因组的DNA片段的重组克隆来实现。,4,限制性内切酶,克隆、转化、培养、鉴定,基因组DNA,基因组文库,5,3.2 基因组信息的可重建性 通过建立叠连群(contig)重建完整序

2、列信息。,6,3.3 文库的大小 即文库中应包含的独立重组子数。 一般来说，DNA片段长，完整基因组文库所含的克隆数越少。反之，越多。 基因组越大，文库应包含的克隆数越多，反之，越少。,7,4 基因组文库的质量标准,一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆； 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序； 克隆片段易于从载体分子上完整卸下； 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。,8,5 基因组DNA文库构建的程序 (噬菌体基因组文库的构建),基因组DNA的分离制备 不同来源的DNA制备方法

3、不同。 一般来说，有液相法和固相法两种。 液相法提取的DNA长度一般在100kb左右，基本可以满足构建各种小插入片段基因组文库的要求。,9,大相对分子质量(high molecular weight,HMW)基因组DNA的提取方法,10,11,基因组DNA的片段化 酶切 部分酶切的主要目的是产生随机性的DNA片段用于构建基因组文库。 DNA分子的物理剪切 DNA溶液的小孔喷射 超声波处理 高速搅拌,12,载体的制备 要求： 载体的去磷酸化处理 载体的纯度,13,重组连接 按照连接酶催化反应的最适条件设置反应体系，同时还应通过预备性实验确立反应体系具体的参数。,14,噬菌体离体包装 重组噬菌体感

4、染大肠杆菌,15,6 基因组文库的扩增筛选 文库的扩增 基于噬菌体载体的基因组文库通过感染大肠杆菌，重组噬菌体在受体细胞中复制增殖并形成噬菌斑以实现增殖。 风险：在进行文库扩增时，很难保证重组分子均等增殖。所以造成有些克隆丢失，有的增加，有的减少。,16,文库的筛选 噬菌斑原位杂交 PCR文库筛选,17,基因组DNA文库,限制性内切酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,18,第二节 cDNA文库构建,高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程

5、度要比直接从基因组克隆简单得多。,19,1 概念 cDNA文库： 将生物特定的组织器官或特定时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录本。,20,2 cDNA文库优点 cDNA克隆以mRNA为材料，特别适合某些病毒基因组结构研究及有关基因的克隆分离。 cDNA文库的筛选比较简单易行。 每一个cDNA克隆对应一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性的杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因序列。 可以在原核中表达。,21,3 对cDNA文库质量评价 3.1文库的代表性 文库中包含的

6、重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息的完整性。 3.2 重组cDNA片段的序列完整性。,22,4 cDNA文库构建的步骤, 分离mRNA； 富集mRNA； cDNA的合成； 黏性末端片段与载体的连接； 离体包装获得重组噬菌体； 检测重组噬菌体效价。,23,cDNA文库的构建：,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,24,25,4.1 细胞总RNA的提取和mRNA的分离,RNA： tRNA、rRNA、mRNA(1%5%） 真核生物的mRNA具有一个polyA的3末端，可以被用于mRNA的分离； oligo(dT):polyA 杂交链在高盐离子浓度下可以保持，在低盐离子浓度下或较高温度下就会分

7、开，利用这一性质从RNA中分离纯化mRNA。,26,27,28,4.2 cDNA第一链的合成, oligo(dT)引导的DNA合成法 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。,29,30,随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis) 根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。 在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3-末端的o

8、ligo(dT)引物一处开始。,31,4.3 第二链cDNA的合成,cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA:cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。 cDNA第二链的合成的方法大致4种： 自身引导合成法 置换合成法 引导合成法 引物衔接头合成法,32,自身引导合成法 获得的单链cDNA3端会形成发夹结构的能力，以此作为第二链合成的引物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。,33,34,置换合成法,以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合

9、酶I 的作用下合成cDNA的第二链。,35,RNase H ：特异水解与DNA 杂交的RNA上的磷酸二酯键，产生带有3OH和5P的产物,36,引导合成法,37,引物-衔接头法,38,5 全长cDNA文库 ( full length cDNA library ),导致cDNA不完整的原因： cDNA第二链合成中聚合酶的外切核酸酶活性 mRNA的降解，它容易从5端降解。起始生物材料、抽提和纯化过程中RNase的污染、机械断裂. 反转录酶的合成特性 与mRNA的分子结构有关 与反转录酶从转录复合体上脱离有关,39,oligo(dG)引导合成全长dscDNA,40,载体引导合成全长dscDNA,41,置换法合成全长dscDNA,42,6 基因组DNA文库与cDNA文库的比较,cDNA文库只包含某种生物体特定组织、特定发育阶段表达的基因(具有时空特异性)。 基因组文库的出发材料是完整的生物基因组DNA，每一个基因都存在于完全的基因组文库中，并不受生物组织或发育时期的影响。,43,cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列， cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难；