MRP3在多种肿瘤细胞系的表达及意义

1、精品文档MRP3在多种肿瘤细胞系的表达及意义 基金项目：上海市科委科研计划项目（编号064119620）通讯作者：张辉 200120上海同济大学附属东方医院普外科高玮 张辉 （上海同济大学附属东方医院）摘要：目的 探讨MRP3（multidrug resistance-associated protein 3，MRP3）蛋白在多种肿瘤细胞中的表达及意义。方法 选用七种肿瘤细胞及人胚肾293T细胞，采用抗MRP3的单克隆抗体通过流式细胞仪及western blot方法检测其MRP3的表达，通过RT-PCR检测细胞在mRNA水平的表达情况。结果 MRP3mRNA在三种人胰腺癌细胞中皆有表达，在其他

2、5种细胞无表达，MRP3蛋白在胰腺癌细胞系BxPC-3及AsPC-1中显著表达。结论 MRP3可能以组织特异性的方式在不同肿瘤细胞中表达，BxPC-3和AsPC-1细胞系是体外胰腺癌耐药研究的良好选择。关键词：多药耐药相关蛋白质类；肿瘤细胞系；表达中图分类号：（R730.21） 文献标志码：A 文章编号：Expresstion and Significance of multidrug resistance-associated protein 3 in different cell linesGAO Wei, ZHANG Hui, (General Surgery of Dongfang H

3、ospital, Tongji University, Shanghai 200120,China)Abstract: Objective To investigate the expression and meaning of MRP3 in different tumor cells. Methods The monoclonal antibody against MRP3 was used to identify the expression of MRP3 by Western Blot and flow cytometer in seven tumor cells and human

4、 embryo kidney cell lines 293T.And RT-PCR was used to detect the mRNA of MRP3 in eight cell lines. Result The mRNA of MRP3 was expressed in three pancreatic carcinoma cell lines.MRP3 protein was observed in BxPC-3 and AsPC-1 cells. Conclusions MRP3 may express in different tumor in tissue-specific m

5、anner.BxPC-3 and AsPC-1 may serve as cellular models for in vitro studies on multidrug resistance of pancreatic carcinoma.Key words: multidrug resistance-associated protein；tumor cell;expression多药耐药相关蛋白（MRP）家族主要参与细胞内外多种复合物的转运，在介导肿瘤药物外排起到了重要的作用，目前已知有9个成员（MRP1-MRP9）1，MRP3是其中之一。以往的研究发现，MRP3在多种肿瘤组织如肝细胞癌

6、、胆管癌、胆囊癌、胰腺癌等皆有表达，推测MRP3可能与一些肿瘤的多药耐药（multidrug resistance，MDR）相关。 本研究中，我们通过传代培养了8种不同的细胞系，利用抗MRP3的单克隆抗体，通过RT-PCR、Western blot 和流式细胞仪方法分析MRP3在人胚肾细胞及7种不同的肿瘤细胞系中的表达状况，为进一步研究MRP3蛋白在不同肿瘤介导的耐药作用奠定基础。1. 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 主要试剂: DMEM、RPMI1640培养基、胎牛血清（Sigma），RNA提取试剂盒（北京天庚生物公司）、鼠抗人MRP3单克隆抗体、鼠抗人MRP5单克隆抗体、鼠抗人-ac

7、tin单克隆抗体 (Santa Cruz), RT-PCR试剂盒(TOYOBO)，ECL显色试剂盒(德国DAKO公司)。1.1.2 实验用细胞：人胰腺癌细胞系AsPC-1、BxPC-3、PANC-1由中国科学院上海细胞库提供，正常人胚肾293T细胞系、肺癌细胞系A549、宫颈癌细胞系Hela、骨髓瘤细胞系TK143、T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat由复旦大学公共卫生临床中心科学研究部提供。1.2 方法1.2.1 细胞培养及处理：将人胰腺癌细胞系AsPC-1、BxPC-3、PANC-1，正常人胚肾293T细胞系、肺癌细胞系A549、宫颈癌细胞系Hela、骨髓瘤细胞系TK143、T淋巴细胞白血病

8、细胞系Jurkat复苏后均置于含10胎牛血清的DMEM培养基的培养瓶中，放置37、5%CO2孵箱中培养，48h更换培养基，待贴壁细胞满瓶后，用0.25胰酶消化、计数、传代。1.2.2 流式细胞仪测定肿瘤细胞表面MRP3表达：取生长状态良好的肿瘤细胞，用0.25%胰酶消化制备成单细胞悬液，调整浓度为1106/ml，取301单细胞悬液，收集离心，PBS洗涤两次，加入鼠抗人MRP3单克隆抗体31，混合均匀后于4孵育1h，PBS洗涤两次。加入羊抗鼠荧光标记抗体，4孵育30min，PBS洗涤两次，用流式细胞仪测定细胞平均荧光强度。以只加二抗和未加任何抗体的细胞作为对照。1.2.3 Western blo

9、t方法测定蛋白：蛋白的提取按文献2所提供的方法进行.用含有相同蛋白的样本进行聚丙烯酞胺凝胶电泳，然后采用半干法转到硝酸纤维素膜上.NC膜用含有50g/L奶粉的TBS封闭过夜，MRP3一抗37孵育lh(1:20稀释)，TBS冲洗之后辣根过氧化物酶标记的二抗37封闭lh，TBS洗涤之后ECL法显色，洗片.选用-actin(Santa Cruz)作为内参，l:200稀释.1.2.4 RT-PCR测定MRP3mRNA：引物参照文献3由上海捷瑞生物工程公司合成：MRP3正义链5,-GGACCCTGCGCATGAACCTG-3,，反义链5，-AGGCAAGTCCAGCATCT CTGG-3，-actin正

10、义链5,- TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3,，反义链5，- CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3，。按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，配制RT-PCR混合物:在0.2m1离心管中加入dNTP2.5l, 10buffer41，逆转录酶(AMN) 0.51, Mg+51，RNA酶抑制剂0.51, Taq酶0.51, RNA0.51, 10M MRP3上下游引物各11,-actin上下游引物各0. 41，总体积补水至251,建立反应体系(以上操作均在冰上进行)。5030min，942min，9410s，5835s，7225s，以上三

11、步骤30次循环；725min,460min。以-actin为内参照，PCR扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，Bio-Rad全自动凝胶图像分析系统扫描定量，以MRP3 mRNA/-actin比值表示MRPI mRNA表达水平的高低。2. 结果流式细胞仪显示，AsPC-1细胞的MRP3蛋白阳性率达68.5%，BxPC-3细胞的MRP3蛋白阳性率为33.6%，较AsPC-1阳性率低。PANC-1细胞MRP3阳性率较低为5.4%，其他细胞的MRP3表达较阴性对照无统计学意义。（图1）A B C 图1 流式细胞仪：（A）BxPC-3细胞MRP3表达情况。（B） AsPC-1细胞MRP3表达情况。（C）

12、PANC-1细胞MRP3表达情况。 Western blot结果显示MRP3只有在人胰腺癌AsPC-1细胞及BxPC-3细胞中表达，而胰腺癌PANC-1及其他5种不同的肿瘤细胞系中都无明显表达。通过成像软件Quantity One 4.5.2与-actin对比后显示，MRP3在AsPC-1细胞中的表达量较BxPC-3高。（图2）图2 Western Blot法测定MRP3蛋白在不同细胞中的表达。RT-PCR：PANC-1、AsPC-1、BxPC-3细胞皆有MRP3 mRNA的表达，其他肿瘤细胞无MRP3的mRNA表达，在三种胰腺癌细胞中，AsPC-1细胞的比达量较高，BxPC-3、PANC-1

13、表达量依次降低。（图3）图3 MRP3 mRNA在不同细胞中的表达情况。3. 讨论 MRP3属于ABC转运蛋白。ABC转运蛋白超家族因含有一个腺苷三磷酸的结合盒而得名，它利用水解ATP的能量对溶质中各种生物分子进行跨膜转运，转运的底物包括:糖、氨基酸、金属离子、多肽、蛋白质、细胞代谢产物和药物等。MRP3也是典型的有机阴离子转运体，在正常肝脏、肾脏、小肠，结肠等均有表达，参与了肝脏细胞代谢产物的外排、肾脏的排泄等正常生理活动，主要转运底物是与谷胱甘肽GSH、硫酸盐、葡萄糖醛酸酯结合的有机化合物 4。MRPs一直被认为是参与肿瘤多药耐药的重要分子，而MRP3可以转运长春新碱、表鬼臼毒、鬼臼噻吩甙

14、、甲氨喋呤等抗癌药物5，因此被认为与临床肿瘤耐药密切相关。以往的研究已发现诸如胆管癌、胆囊癌、肝细胞癌、乳腺癌、胰腺癌皆有MRP3表达4，特别是胰腺癌、胆囊癌对化疗药的耐药一直是临床上非常棘手的问题。本实验中，TK143细胞、A549细胞、Jurkat细胞、Hela细胞的mRNA及蛋白均无MRP3的表达，临床中这些细胞来源的骨髓瘤、肺癌、T淋巴细胞白血病、宫颈癌等对化疗相对敏感；来源于胰腺癌的三种细胞系皆有MRP3 mRNA的表达，其中BxPC-3和AsPC-1细胞膜表面还有MRP3蛋白的高表达，而胰腺癌的化疗效果是非常差的，这些提示MRP3在肿瘤耐药特别是胰腺癌的多药耐药中发挥了重要的作用。

15、 有趣的是，手术切除的胰腺癌标本也独特高表达MRP3，且与患者的预后密切相关。临床中胰腺癌对表鬼臼毒、长春新碱等一线抗癌药物确实不敏感，特别是对甲氨喋呤基本无效，这很可能与MRP3的转运底物特点有关。另外，未接受术前化疗的胰腺癌患者治疗予以抗肿瘤药物后，其MRP3可被诱导增量，导致其耐药性逐渐显现3。本实验胰腺癌的三种细胞系按癌细胞分化程度排列，依次为：高分化BxPc-3细胞，中分化AsPC-1细胞，低分化PANC-1细胞6。结果显示MRP3在中高分化的胰腺癌细胞系中表达量高，在低分化的胰腺癌细胞mRNA表达相对较低，且其表面蛋白无法测得，提示MRP3表达随胰腺癌细胞的分化程度升高而升高，这有

16、助于解释中、高分化胰腺癌对化疗的敏感性较低分化癌差的临床现象。此外，Chang7研究发现MRP3在肝脏再生中逐渐诱导，肝脏再生是个细胞逐渐分化的过程，这与本实验分化程度越高MRP3表达越高的现象相一致。胰腺癌手术切除率低，化疗效果差，如果能逆转其多药耐药性，则有助于改善患者生存率。肿瘤的MDR机制较为复杂，本实验结果显示MRP3在胰腺癌的MDR扮演重要角色，这为逆转胰腺癌的MDR提供了良好的靶点。目前主要的逆转策略有：寻找MRP3逆转剂；应用MRP3特异的单克隆抗体免疫治疗，阻断其药物转运功能；利用反义寡聚脱氧核苷酸技术或干扰RNA技术抑制基因表达等。此外，本实验中BxPC-3和AsPC-1细

17、胞的MRP3表达情况与临床胰腺癌标本表达情况相符，故可以用于胰腺癌多药耐药的体外研究。我们亦将在此基础上，进一步研究胰腺癌的多药耐药机制及逆转策略。 参考文献：1. Zhou SF, Wang LL, Di YM,et al. Substrates and inhibitors of human multidrug resistance associated proteins and the implications in drug development. Curr Med Chem, 2008,15(20):1981-2039. PMID: 186910542. Sambrook J，Fr

18、itseh EF，Maniatis T.Molecular Cloning:a laboratory manual.2rd ed.NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989:870-8773. Konig J, Hartel M, Nies AT, et al. Expression and localization of human multidrug resistance protein (ABCC) family members in pancreatic carcinoma. Int J Cancer, 2005, 115(3):359-367. PMID: 156883704. 高玮,张辉. 多药耐药相关蛋白3的研究进展, 国际肿瘤学杂志, 2009,4(4):23-26。5. Kruh GD, Belinsky MG