第二章 食品微生物检验的基本原理和方法

1、食品微生物检验的基本原理、方法和流程,第二章,一、微生物实验的准备,玻璃器皿的洗刷与准备 洁净剂及使用范围 洗涤液的制备及使用注意事项 洗涤玻璃仪器的步骤与要求 玻璃仪器的干燥 玻璃器皿的包装和灭菌,实验前的准备,消毒与灭菌 基本概念 干热灭菌 湿热灭菌 其它消毒和灭菌方法,消毒： 是指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的病原菌营养体的方法。 灭菌： 是指用物理和化学方法杀死物体表面和内部的所有微生物，使之呈无菌状态。,灭菌设备,蒸汽出口,二、微生物实验操作,2.1 无菌操作的概念 2.2 酒精灯 2.3 接种针（环），制作，使用 2.4 移液管和加样枪的使用 2.5 倾注平皿 2.6 液液接

2、种 2.7 平板划线,微生物接种工具和方法,在微生物检验中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作 为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。 接种和分离工具 1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀,斜面接种技术,无菌操作,平板划线,三、微生物实验的观察,3.1 显微镜观察 3.2 平板菌落观察 3.3 斜面培养物的观察 3.3 液体培养物的观察,3.1 显微镜观察,活菌观察：悬滴法和压滴法，运动特性。 染色：单染色

3、，革兰氏染色。,细菌的基本形态主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类，近年还发现星状和四方形细菌等。 细菌形态受培养时间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。,革兰氏染色法,1.涂片固定,2.单染结晶紫染液第一次染色 1min,3.媒染碘-碘化钾溶液浸湿30S,4. 脱色95%乙醇溶液进行颜色洗脱,5.复染红色的藩红染液第二次染色,呈现第二次染色的效果红色；称革兰氏阴性菌（红阴G -）,细菌呈现第一次染色的效果紫色，革兰氏阳性菌（紫阳G）；,3.2 平板菌落观察,大小 形状 色泽 边缘 透明度 湿润度 溶血性,大肠杆菌在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态： （1）光滑型： 菌落边缘整齐，

4、表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中容易分散。 （2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易在生理盐水中自凝。 （3）粘液型：常为含有荚膜的菌株。,菌落形态学Bacterial Colony Morphology,有荚膜的细菌菌落较大并且表面光滑，而没有荚膜的则表面较粗糙； 具有芽孢的细菌菌落表面常有褶皱并且不透明。 没有鞭毛不运动的细菌，特别是球菌，常形成较小、较厚、边缘较整齐的菌落；有鞭毛的细菌则较大而扁平，边缘波状、锯齿状等；,蜡样芽孢杆菌菌落,枯草芽孢杆菌菌落,3.3 斜面培养物的观察,丝状 树状 念珠状 扩展状 假根状 刺毛状,3.4 液体培养物的观察,未接种 形成薄膜 形成

5、沉淀 混浊生长 絮状生长,对氧气要求：专性需氧菌 微需氧菌 兼性厌氧菌 专性厌氧菌 对CO2要求： 5% CO2,水 碳源 氮源 无机盐 生长因子 有些细菌需要,培养微生物,4、对气体要求,3、PH,2、温度,1、营养物质,微生物的培养 微生物培养中的氧气条件,培养设备：包括接种室、恒温培养室、恒温培养箱、液体发酵摇床、厌氧培养罐等。 好氧培养：例如平板培养、斜面培养、浅层液体培养、液体振荡培养或通气搅拌培养等都属于好氧培养的方法。 厌氧培养：除了最简便的深层液体培养以外，可以采用物理、化学或生物学的方法来排除培养容器中的空气或空气中的氧气，创造厌氧条件。对于严格厌氧的微生物，要用化学和物理并

6、用的方法。在进行厌氧培养时，可以用指示剂检查系统中的还原条件，一般实验室中常用的如葡萄糖美兰指示剂。,微生物的培养 微生物培养中的厌氧条件,生物学方法：利用植物呼吸作用，造成厌氧条件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入发芽种子，因种子的呼吸作用增强，吸收氧气，创造厌氧条件。此法简易，但厌氧程度低。 化学方法：利用焦性没食子酸吸收容器中的氧气。在容器的一边放一包用吸水紙包好的焦性没食子酸，在另一边放入碱液，容器密封后，让碱液流向焦性没食子酸一边，两者反应时吸收容器中的氧气，创造厌氧条件。 物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器内的空气或再充入其它惰性气体，以保证厌氧条件。抽气前，容器内放入指示剂和培

7、养物。一般为达到严格厌氧目的，常采用物理和化学相结合并用的方法。,微生物的培养 微生物培养中的厌氧培养,美兰氧化还原指示剂：0.006N NaOH 0.015% 美兰溶液 6 葡萄糖溶液 上列三种溶液在使用时等量混合，加热使美兰退色，迅速放入厌氧罐中。,常见的生化反应：根据细菌具有不完全相同的酶，分解不同营养物质的特点，用生化方法来鉴定细菌。,对 糖 的 发 酵,对 蛋白质的发酵,枸橼酸盐利用试验,尿素酶试验,甲基红（MR）试验,靛基质试验,硫化氢试验,糖发酵试验,VP试验,其他试验,过氧化氢酶试验,硝酸盐还原试验,淀粉水解试验,糖酵解试验,不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用（产

8、酸）或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。,葡萄糖：,七叶苷：,淀粉水解试验,某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。,V-P试验,某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反应。,甲基红（Methyl Red）试验,肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5

9、以下，使甲基红指示剂变红（+）；如酸性物质进一步分解，会使pH上升在5.4以上，使甲基红指示剂变黄（-）。,靛基质（Imdole）试验,某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物（+）；无色则为阴性。,含硫有机物（如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸）能被部分细菌分解产生H2S，H2S和培养 基中的铅盐或铁盐反应，形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀。,硫化氢试验,枸椽酸盐试验,某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变为兰色（+）；阴性则不变色

10、（绿色）。,接种硝酸盐肉汤，35培养5天， 加入0.2ml试剂A（对氨基苯磺酸），再加入 0.2ml试剂B（-萘胺），轻摇混合。,红色：阳性,没有颜色变化： 加入少量锌粉 变红阴性（硝酸盐未被还原） 不变阳性（亚硝酸盐已经分解成氨和氮）,硝酸盐还原试验,原理：某些微生物可以将硝酸盐还原成亜硝酸盐，在酸性条件下，转化为亚硝酸，与指示剂结合，呈红色（+）。,菌落平板1滴3的过氧化氢。 阳性则产生大量气泡。,过氧化氢酶：,过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解成水和氧。,氨基酸脱羧酶试验,某些细菌能产生氨基酸脱羧酶, 可使赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用, 生成胺类物质和CO2。胺类物质使培养基呈碱性变

11、紫色，为阳性, 如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。,血浆凝固酶试验,原理：致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，附着在细菌的表面，形成凝块；或作用于血浆凝固酶原，使它成为血浆凝固酶，从而使抗凝的血浆发生凝固现象,为阳性。,尿素酶（Urease）试验,有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。,1、未接种 2、尿素酶阳性 3、尿素酶阴性,动力观察：,MOTILITY TEST1. Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）：Motile 2. Staphylococcus aureus：Non-motile

12、3. Bacillus subtilis：Motile,Principle The lower agar concentration in the medium allows limited movement of motile bacteria from the area of the stab. Motility will be detectable as diffuse growth radiating from the stab line. A special dye, a tetrazolium salt (TTC) may be added to make the radiatin

13、g growth more visible as the reddish diffuse area.,IMViC试验,IMViC就是：I吲哚（indoltest） M甲基红（methylredtest） VV-P（Voges-Prolauertest） C柠檬酸盐（citratetest） 这四个生化试验，合称IMViC试验，主要用于肠道菌鉴定。,血清学反应是指：相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。,习惯上将经典的血清学反应分三种类别： 凝集反应 沉淀反应 补体结合反应。,血清学试验,O

14、抗原：存在于细胞壁脂多糖（LPS）层，具有属、种特异性。其特异性取决于LPS分子末端重复结构多糖链的糖残基种类的排列。O抗原耐热，100不被破坏。 H抗原：存在于鞭毛蛋白。不耐热，6030分钟即被破坏。H抗原的特异性决定于多肽链上氨基酸的排列顺序和空间结构。细菌失去鞭毛后，运动随之消失；同时O抗原外露，是为H-O变异。 荚膜或包膜抗原：位于O抗原外围，能阻止O凝集现象。多糖性质，但6030分钟可去除之。 毒力抗原（Vi抗原，ViVirulence）Vi antigen：定位于革兰氏阴性细菌菌体抗原（O抗原）外侧的易热抗原。一般认为与毒力有关，因此称为毒力抗原。与氯化铁起反应，可用电子显微镜证实

15、其存在。一般认为毒力抗原由N-乙酰氨基糖醛酸的聚合物组成，在血清学上可与其他表面抗原区别开来。,抗原种类：,鞭毛抗原（H）,菌体抗原（O）,K或Vi抗原,三、微生物学检验,食品微生物学检验： 运用标准的仪器设备、试验器材，按国家标准方法项目要求快速、准确地检验目的菌。 检验的范围： 生产环境的检验：水、空气、地面、墙壁 原材料的检验：包括添加到食品中的所有材料 食品加工、运输、贮存、销售过程中的检验：从业人员、材料、工具、设备的卫生 食品本身的检验：半成品及出厂的产品、中毒的产品、值得怀疑的产品。 食源性疾病中食品样品 食品安全事件中食品样品,微生物检验流程,（一）、样品的采集,取样意义 （目

16、的） 监督管理（企业、执法机构等） 为某一特殊目的（如食源性疾病、食物中毒、不明原因的疾病）搜索证据。 采样原则：确保所采集的样品具有代表性 抽样坚持随机原则 采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能外来污染。 保存和运输的过程，防止样品中原有微生物的数量和质量变化，保持样品的原有状态。,1、采样的原则 具有代表性,代表采样当时的及样品整体的基本情况（随机性、均匀性和数量） 代表样品整体中微生物的数量、种类和活力（生长能力）（如防止外源性污染） 代表样品整理的质量（理化性质），如防止样品变质。,2、采样方案,采样方案：在采样计划的基础上，制定的采样实施细则，包括用具的准备、人员安排、采样过程质量

17、控制、运输送样安排等。 在采样方案中，用于分析的样品的代表性是至关重要的，即样品的数量、大小和性质对结果判定产生重大影响。 按照相应产品标准中的规定执行。,各取样点,原料：原始材料、添加剂、辅助材料及生产用水等； 生产线样品：食品生产过程中不同加工环节所取的样品； 库存样品：测定保质期样品质量 市场样品：测定流通过程中微生物变化 口岸样品：除了满足合同条款外，还有满足进口国相关法律规定。 可疑食品样品（包括食源性疾病和食物中毒等）,各种取样方案,进出口贸易合同对食品抽样量有明确规定的，按合同规定抽样。 合同没有具体抽样规定的，可根据检验的目的，产品及被抽样品批的性质和分析方法的性质确定抽样方案

18、。 参照同一产品的品质检验抽样数量抽样，或按单位包装件数N的开平方值抽样。 参照GB 4789.1中华人民共和国国家标准 食品微生物学检验 总则。,采样类型,基本原则 （1）各种微生物本身对人的危害程度各有不同。 （2）食品经不同条件处理后，其危害度变化情况：降低危害度；危害度未变；增加危害度。 根据（1）（2）的情况来设定抽样方案并规定其不同采样数。 采样方案：分为二级和三级采样方案。,几个字母代号,n：同一批次产品应采集的样品件数； c：最大可允许超出m值的样品数； m：微生物指标可接受水平的限量值； M： 微生物指标的最高安全限量值。表示边缘的可接受数与边缘的不可接受数之间的界限。,二级

19、抽样方案,二级法只设有n、及m值 以其一点作为食品微生物的限量值，只设合格判定标准m值，超过m值的，则为不合格品。 以生食海产品鱼为例 n=5，c=0，m=102，n=5即抽样5个，c=0即意味着在该批检样中，未见到有超过m值的检样，此批货物为合格品。 在中等或严重危害的情况下使用二级抽样方案,三级抽样方案,三级法有n、c、m及M值。M即附加条件后判定合格的菌数限量。 设有微生物标准m及M值两个限量，超过m值的检样，即算为不合格品。其中以m值到M值的范围内的检样数，作为c值，如果在此范围内，即为附加条件合格，超过M值者，则为不合格。 例如：冷冻生虾的细菌数标准 n=5，c=3，m=101，M=

20、102，其意义是从一批产品中，取5个检样，经检样结果，允许3个检样的菌数是在mM值之间，如果有3个以上检样的菌数是在mM值之间或一个检样菌数超过M值者，则判定该批产品为不合格品。 对健康危害低的情况下建议使用三级抽样方案,食品中致病菌限量标准,食品中致病菌限量标准,随机抽样方案,在现场抽样时，可利用随机抽样表进行随机抽样。随机抽样表系用计算机随机编制而成，包括一万个数字。 其使用方法如下：a先将一批产品的各单位产品（如箱、包、盒等）按顺序编号。如将一批600包的产品编为1、2600。b.随意在表上点出一个数。c.根据单位产品编号的位数进行抽样。重复抽样，直到完成应抽样品件数为止。,非随机取样计

21、划,在食品生产或贮藏、销售的整个中，微生物变化显著； 整堆食品贮藏温度和其它条件变化显著； 出现食物中毒或流行性疾病暴发； 出现以上情况，需要非随机取样，并同时检测环境情况。,食源性疾病及食品安全事件中食品样品的采集,由工业化批量生产加工的食品污染导致的食源性疾病或食品安全事件，食品样品的采集和判定原则按二级或三级采样方案执行。同时，确保采集现场剩余食品样品。 由餐饮单位或家庭烹调加工的食品导致的食源性疾病或食品安全事件，食品样品的采集按GB14938中卫生学检验的要求，以满足食源性疾病或食品安全事件病因判定和病原确证的要求。,3、取样方法按不同目的制定,明确目的，确定采样方案（由卫生监督员和

22、检验员讨论确定）； 首选已包装好的小包装样品（500g/mL）； 若是大包装采集检验需用量的5倍以上。 a、无菌操作(灭菌的容器、工具)； b、固体食物：要代表性的多点采样后混合均匀； c、液体食物：要注意表面、深度及摇均匀 d、流水线：前、中、后，分点取样； e、检验表面污染（包括食品、生产工具）：涂、擦（用灭菌棉签、检验纸片） 。,常见的采样方法,1500g及以下的即食包装食品：直到检验前不要开封，以防污染。 2大容器包装的非即食液体食品：抽样前摇动均质，取样不超过其容量的四分之三，测温，记录，冷却（ 0-4 ），取样检测前再混匀一次。 3大容器包装的非即食固体和固体食品：每份样品在几个不

23、同部位取样，放入一个灭菌容器内；肉类、鱼类或类似食品要将表面样品和深层样品分开保存，防止交叉污染。,4大容器包装的非即食冷冻食品：保持冷冻状态。取样时可以用驹子、木钻等获取深层样品。样品一旦融化，不可使其再冻，保持冷却即可。 5生产过程中的抽样：划分检验批次，应注意同批产品质量的均一性 。 6、表面取样：通过惰性载体将表面样品上的微生物转移到合适的培养基中进行微生物检测。适应于菌体数量较少的样品。载体包括清水、拭子、胶带等，其它有琼脂肠、影印盘、触片法、表面切片法等,散装食品或现场制作食品,根据不同食品的种类和状态及相应检验方法中规定的检验单位，用无菌采样器现场采集5倍或以上检验单位的样品，放

24、入无菌采样容器内, 采样总量应满足微生物指标检验的要求。,样品的种类,大样：整批检验。 中样：采样员从大样各部分取得的混合样。 小样：检验员用来检验的样品。 表面污染：50cm2 （5cm 210处） 罐头食品：罐/批、班次 一般每个品种3罐，可以以每配料罐或灭菌锅为一批。,取样前的准备工作,建立一个无菌取样的分析清单 ，按清单准备工具、容器、设施（衣服、发网等）； 盛样品的容器应当被预先标识，如样品号、取样日期、取样人等； 检查所有取样设施、工具和容器的灭菌日期、灭菌时间，并做好标识； 注意干冰或湿冰的准备及保存。,无菌采样,无菌采样，意味着取样过程中，避免操作过程引起污染。一个无菌样品的采

25、集，应该通过这样一种方式，即：在收集过程中，本身应避免污染，然后放入消毒容器中。,不能冤枉好人啊！,4、采样的标识,对采样前后的大、中、小样均要进行标识，注明：编号、品名、来源、批号、数量、时间、采样人姓名、采样地点、保存条件等信息，并填写记录表格。 盛样容器必须有和样品一致的标记，并确保标记牢固并防水。 工厂一般用红卡和蓝卡来做已采样标识。 样品运送前必须封识样品容器。,样品的运送 尽可能保持样品原有状态,防护包装：液体防漏、冷冻食品防融，一般用减震材料（泡沫材料）和隔热箱（内装干冰以维持0）； 尽快送检：3小时； 冷冻食品应保持冷冻状态，非冷冻食品保持15； 填写送检单，内容与标识单相似，

26、有运送人签字。 不能由专人运送的样品，可以托运，但要确保安全。,（二）样品检验,样品的接收 1、查对样品：根据送检单对照样品，要求样、单一致； 2、填表登记：内容与标识相似，注明接收日期等；一般先微检，后化检。 3、分类保藏：冷藏、冷冻或室温。 检验的准备：按国标法准备药品、仪器、培养基、工具、无菌水等,样品的保存,样品到实验室后应在36h内检验（贝类是6h）。 进行必要和清晰的标识：样品名称、样品描述、样品批号、企业名称和地址、取样人、时间、地点、温度和测试目的。 样品在保存过程中采用适当的方法，取保样品和微生物的状态，仍能代表取样时的特性。（特别需要注意温度、pH值、氧气等条件变化） 对样品的贮存过程应有记录。,样品的预处理,液体样品：黏度不超过新鲜牛乳的粘性食品 先要匀表面消毒用无菌工具开罐吸样（2.5cm深度） a、含CO2的饮料：须排除CO2（表面消毒、开罐、倒入无菌小瓶、盖无菌纱布、轻摇使气体逸出。） b、酸性饮料：pH4.5 用灭菌的10%Na2CO3调至中性。 固体样品：注意均质。例如：