《发酵工程3培养基》PPT课件.ppt

1、第3章培养基,培养基是什么?,培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素，用于单种微生物培养和鉴定。,天然培养基 指一类利用动、植物或微生物体包括其提取物制成的培养基。如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。 组合培养基 又称为合成培养基或综合培养基，是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基。如葡萄糖铵盐培养基、淀粉硝酸盐培养基等。 半组合培养基 指一类主要以化学试剂配制，同时还加有某种或某些天然成分的培养基。例如，马铃薯蔗糖培养基。,

2、一、发酵工业培养基的基本要求,1、必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。 2、有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质的转化率。 3、有利于提高产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。 4、有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。 5、尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。,6、原料价格低廉，质量稳定，取材容易。 7、所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。 8、有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”物质。,1、碳源 作用：提供微生物营养所需的碳元素，同时又提供能源。 最适碳源CHO型。 常用碳源：糖蜜、淀粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖。

3、有些微生物可利用油脂（豆油、菜油、葵花子油等）、有机酸（乳酸、柠檬酸、乙酸等）、烃和醇类（正1418碳烷烃、乙醇等）。,二、培养基的成分与来源,2、氮源 作用：用于构成菌体细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢产物。 有机氮源：花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、尿素、酒糟等。 无机氮源：铵盐（氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵）、硝酸盐（硝酸钠、硝酸钾）、氨水等。 异氧微生物对氮源的利用顺序：NCHO或NCHOX类、NH类、NO类、N类。,3、无机盐及微量元素 主要无机元素：磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁等。 微量无机元素：钼、锌、钴、铜、硼、溴等。 磷、硫

4、是构成细胞物质的重要成分，钾、钠、镁主要是调节和控制原生胶的胶体状态、维持膜的透性并激发某些酶的活性。 微量无机元素量微，但往往会强烈刺激微生物的生长发育。,4、生长因子 生长因子是微生物生长发育过程中不可缺少而需要量又极少的一类特殊营养物质。 它包括了维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶类碱基等。营养物质中的酵母膏、玉米浆或麦芽浸出物等都含有丰富的生长辅助物质。,5、发酵的前体与促进剂 前体：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构没有多大的变化，但产物的产量却因加入前体而有较大的提高。如青霉素G的发酵中加入苯乙酸。,发酵过程中所用的一些前体物质

5、,促进剂：加入后，能使生产菌株大幅度提高目标生产能力的物质。如Met或Leu促进头孢菌素C的生物合成；聚乙烯醇衍生物防止菌丝结球，提高糖化酶的产量；添加表面活性剂，可增加底物和产物的渗透性，促使固体物分散，强化传质和传氧，从而促进产物的生产。,三、微生物的培养基类型,1.天然培养基(natural medium) 凡利用生物的组织、器官及其抽取物或制品配成的培养基，称为天然培养基。 优点是配制方便、经济、营养丰富，但是，它的化学成分不清楚或不稳定(受产地、品种、保存加工方法等因素影响)。常见的天然培养基成分有：麦芽汁、肉浸汁、鱼粉、麸皮、玉米粉、花生饼粉、玉米浆及马铃薯等。,用于天然培养基的原

6、料(玉米淀粉等原料)往往需要进行去杂、粉碎等处理，然后进行过筛、输送至发酵罐。,表 几种天然培养基原材料的特性,2.合成培养基(synthetic medium) 使用成分完全了解的化学药品配制而成的培养基称为合成培养基。 合成培养基的优点是：成分已知、精确、重复性好。但价格较贵，培养的微生物生长较慢。适用于实验室进行微生物生理、遗传育种及高产菌种性能的研究。培养放线菌的高氏一号培养基和培养真菌的察氏培养基都属于合成培养基。,3.半合成培养基(semi-defined medium) 由部分天然材料和部分已知的纯化学药品组成的培养基称为半合成培养基。 例如，培养真菌用的马铃薯蔗糖培养基等。严格

7、地讲，凡含有未经特殊处理的任何合成培养基，实际上都只是一种半合成培养基。特点是配制方便，成本低，微生物生长良好。发酵生产和实验室中应用的大多数培养基都属于半合成培养基。,4.液体培养基(liquid medium) 各营养成分按一定比例配制而成的水溶液或液体状态的培养基称为液体培养基。工业上绝大多数发酵都采用液体培养基。实验室中微生物的生理、代谢研究和获取大量菌体是也常利用液体培养基。,5.固体培养基(solid medium) 固体培养基一般是指液体培养基中加入一定量的凝固剂配制而成的固体状态的培养基。此外，固体营养物(如麸皮、米糠、木屑、土豆块、玉米粉)与水和盐等混合构成的疏松状培养基也属

8、于固体培养基。固体培养基在科学研究和生产实践中具有很多用途，例如它可用于菌种分离、鉴定、菌落计数、检测杂菌、选种、育种、菌种保藏、抗生素等生物活性物质的效价测定及获取孢子等。,6.半固体培养基(semi-solid medium) 半固体培养基是指琼脂加入量为0.2-0.5%而配制的固体状态的培养基。半固体培养基有许多特殊的用途，如可以通过穿刺培养观察细菌的运动能力，进行厌氧菌的培养及菌种保藏等。,7.种子培养基(seed culture medium) 种子培养基是适合微生物菌体生长的培养基，目的是为下一步发酵提供数量较多，强壮而整齐的种子细胞。一般要求氮源、维生素丰富，原料要精。,8.发酵

9、培养基(fermentation medium) 用于生产预定发酵产物的培养基。一般的发酵产物以碳为主要元素，所以，发酵培养基中的碳源含量往往高于种子培养基。若产物的含氮量高，应增加氮源。在大规模生产时，原料应该价廉易得，还应有利于下游的分离提取工作。,9.基本培养基(Minimal Medium，MM) 基本培养基又称最低限度培养基，指能满足某菌种的野生型(原养型)菌株最低营养要求的合成培养基。不同微生物的基本培养基很不相同，有的极为简单，如大肠杆菌的基本培养基；有的极为复杂，如一些乳酸菌、酵母菌或梭菌的基本培养基。基本培养基有时也需要添加生长因子等。,若在基本培养基中加入富含氨基酸、维生素

10、、碱基等生长因子的营养物质，如蛋白胨、酵母膏等，就可满足各种营养缺陷型的生长需求，这种培养基称为完全培养基(Complete Medium，CM)。 若在基本培养基中只是针对性地加入一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型生长，那么，这种培养基称为补充培养基(Supplement Medium,SM)。,10.加富培养基(enriched medium) 加富培养基是在普通培养基中加入血、血清、动(植)物组织液或其它营养物(或生长因子)的一类营养丰富的培养基。它主要用于培养某种或某类营养要求苛刻的异养型微生物，或者用来选择性培养(分离、富集)某种微生物。具有助长某种微生物的生长，抑制其它微生

11、物生长的功能。广义上讲，保藏培养基和鉴别培养基也属于加富培养基。,11.选择性培养基(selected medium) 根据某种或某类微生物的特殊营养要求，或对某些物理、化学条件的抗性而设计的培养基，称为选择性培养基。 目的是利用这种培养基把某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来。混合样品中数量很少的某种微生物，如直接采用平板划线或稀释法进行分离，往往因为数量少而无法获得。,选择性培养基的设计主要方法有两种： 一是根据某些微生物对碳源、氮源的需求而设计。 以纤维素为唯一碳源的培养基可用于分离纤维素分解菌； 用石蜡油来富集分解石油的微生物； 用较浓的糖液来富集酵母菌等。,二是根据某些微生物

12、的物理和化学抗性设计的， 如分离放线菌时，在培养基中加入数滴10%的苯酚，可以抑制霉菌和细菌的生长； 在分离酵母菌和霉菌的培养基中，添加青霉素、四环素和链霉素等抗生素可以抑制细菌和放线菌的生长； 结晶紫可以抑制革兰氏阳性菌，培养基中加入结晶紫后，能选择性地培养革兰氏阴性菌； 7.5%NaCl可以抑制大多数细菌，但不抑制葡萄球菌，从而选择培养葡萄球菌。,12.鉴别培养基(differential medium) 在培养基中添加某种或某些化学试剂后，某种微生物生长过程中产生的特殊代谢产物会与加入的这些化学物反应，并出现明显的、肉眼可见的特征性变化，从而使该种微生物与其它微生物区别开来。这种培养基称

13、为鉴别培养基。,例如：用于检测饮水、乳品中是否含肠道致病菌的伊红-美兰乳糖培养基，即EMB(Eosin Methylene Blue)培养基。其成分是：蛋白胨10克，乳糖10克，K2HPO4 2克，2%伊红 20ml，0.325%美兰20ml, 蒸馏水1000ml, pH7.2,其中的伊红和美兰两种苯胺染料可以抑制革兰氏阳性菌和一些难培养的革兰氏阴性菌。试样中的多种肠道菌会在EMB培养基上产生相互易区分的特征菌落，因而易于辨认。大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量混合酸，使菌体带H+，很容易染上酸性染料伊红，伊红又与美兰结合，其复合物为黑色，所以，大肠杆菌的菌落呈紫黑色并带金属光泽，菌落较小。

14、产气杆菌产酸弱，菌落呈棕色；变形杆菌不能发酵乳糖，菌落无色、透明。,四、发酵培养基设计的原理,1、营养物质应满足微生物的需要 不同营养类型的微生物对营养的需求差异很大，所以，应根据所培养菌种对各营养要素的不同要求进行配制。 而且，营养物的浓度及配比应恰当，营养物的浓度太低，则不能满足微生物生长的需要，浓度太高，又会抑制微生物的生长。如糖和盐都是良好的营养物质，但是，浓度升高，则有抑菌作用。,碳氮比(C/N)一般指培养基中元素C与N的比值。为方便测定和计算，人们常以培养基中还原糖含量与粗蛋白含量的比值来表示。 在考察培养基组成时，人们常以碳氮比作为一个重要的指标。一般培养基的C/N比为100：0

15、.5-2；在谷氨酸生产菌发酵中，C/N比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累量较少；当C/N为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸大量积累。,在设计营养物配比时，还应该考虑避免培养基中各成分之间的相互作用。如蛋白胨、酵母膏中含有磷酸盐时，会与培养基中钙或镁离子在加热时发生沉淀反应。在高温下，还原糖与蛋白质或氨基酸也会相互作用产生褐色物质。 在培养基配制时，可添加化学试剂补充宏量元素。其中，首选的是K2HPO4和MgSO4，因为它们包含了四种宏量元素。对于微量元素，一般化学试剂、水及器皿上均有存在。,2、菌体的同化能力 有些微生物能分泌水解酶（淀粉酶、蛋白酶等），能利用淀粉、黄豆粉、花生饼粉、玉米

16、浆等复杂原料作为培养基；而不能分泌水解酶的微生物则只能利用小分子物质，以淀粉为原料时需先进行“糖化”处理。,3、培养基对菌体代谢的阻遏与诱导的影响 在配制培养基考虑碳源和氮源时，应根据微生物的特性和培养的目的，注意速效碳（氮）源和迟效碳（氮）源的相互配合，发挥各自的优势。 葡萄糖效应：当菌体利用葡萄糖时产生的代谢产物会阻遏或抑制某些产物合成所需的酶的形成或酶的活性。,在酶制剂生产过程中，应考虑碳源的分解代谢阻遏的影响。对许多诱导酶来说，易被利用的碳源不利于产酶，而一些难被利用的碳源对产酶有利。 微生物利用氮源的能力因菌种、菌龄的不同而有差异。在生长早期容易利用易同化的铵盐和氨基氮，在生长中期则

17、由于细胞代谢酶系已形成，利用蛋白质的能力增强。因此，在培养基中有机和无机氮源应当混合使用。,有些产物受氮源的诱导与阻遏。除个别微生物外（如黑曲霉生产酸性蛋白酶需高浓度的铵盐），通常蛋白酶的产生受培养基中蛋白质或脂肪的诱导，而受铵盐、硝酸盐以及氨基酸的代谢阻遏。这时应选取蛋白质等有机氮源为主。,4、物理化学条件适宜 1）pH值 各大类微生物一般都有它们生长繁殖的最适pH。细菌的最适pH一般在7.0-8.0，放线菌在pH7.5-8.5间，酵母菌在pH3.8-6.0间，霉菌在pH4.0-5.8之间。对于具体的微生物菌种来说，它们都有各自特定的最适pH范围，有时会大大突破上述界限。,在微生物生长繁殖过

18、程中会产生引起培养基pH改变的代谢产物，尤其是不少微生物有很强的产酸能力，如不适当地加以调节，就会抑制甚至杀死其自身。在设计它们的培养基时，就要考虑到培养基的pH调节能力。一般应该加入磷酸缓冲液或CaCO3，使培养液的pH 稳定。,调节K2HPO4和KH2PO4两者浓度比，可获得从pH6.0到pH7.6间一系列稳定的pH，当两者等摩尔浓度比时，溶液的pH可稳定在6.8。 其反应式如下： K2HPO4 + HCl KH2PO4 + KCl KH2PO4 + KOH K2HPO4 + H2O,2）渗透压 等渗溶液适宜微生物的生长，高渗溶液会使细胞发生质壁分离，而低渗溶液则会使细胞吸水膨胀。 3）氧化还原电位 一般来说好氧微生物的Eh值为+0.3-+0.4V；兼性厌氧微生物在+0.1V以上时进行好氧呼吸，在+0.1V以下时则进行发酵，厌氧微生物只能在+0.1V以下才能生长。,5、根据培养的目的 培养基的成分直接影响着培养的目标。在设计培养基时必须考虑是要培养菌体，还是要积累产物，是实验室培养还是大规模发酵等问题。 用于培养菌体的种子培养基营养成分应丰富，尤其是氮源含量宜高