液相色谱条件的分析和建立课件

1、液相色谱条件的分析和建立主讲人 :日期 : 2010年11月地点：武汉,HPLC分离原理,样品组分在流动相和固定相之间进行分配，由于不同组分与固定相之间的交互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上的移动速率不一样，从而产生色谱分离。(必要条件),不同类型样品的方法选择,色谱柱的选择,根据分离方式分类 (1)正相色谱：SiO2； CN；NH2 (2)反相色谱：C18；C4；C8；CN；NH2 ；苯基 (3)离子交换色谱： 阳离子官能团：SO3H磺酸基、COOH羧基等 阴离子官能团：R4N季铵基、-氨基等 (4)凝胶色谱：水溶性凝胶过滤（GFC）； 油溶性凝胶渗透

2、（GPC） (5)其它类型：手性柱等,1.填料基质：硅胶、氧化铝、聚苯乙烯等 2. 键合相： C4、C8、C18、苯基、氨基、氰基等 3.孔径：60-100A 分子量2000 4.粒径：2um-10um 5.内径：10mm以下（分析）， 10mm以上（制备） 6.长度：100、150、250、300mm,色谱柱选择,色谱柱填料选择,粒度均匀（3，3.5, 5 um), 粒径小，柱压高，理论塔板数高，容易堵柱。 低酸度表面(硅醇基团被屏蔽），可以减少拖尾 宽的pH 范围，可以有较大的调节自由度,色谱柱选择,长度：75mm,150mm,250mm,压力和理论塔板正比与柱长 内径：2mm,4.6mm

3、,10mm 粒径：3um, 3.5um, 5um 孔径：100A,300A,流动相选择,溶 剂 截止波长(nm)水 190 乙腈 190 甲醇 210乙醇 210异丙醇 210 正己烷 210 四氢呋喃 210 二氯甲烷 240 氯仿 240,甲醇和乙腈的紫外吸收图,线性范围 和检出限 度都有影 响,不同混合溶剂的粘度比较,分离度（R1.5）和峰型（1.05T0.95）,可接受的分离条件K,可以接受的分离应该是1k20,or 2k10 better。 K=(tr-t0)/t0 T0指 死时间，一般相当于溶剂峰出峰时间 K 与流速变化关系不大，K小受干扰大，k大则分析时间太长。,理论塔板数,分离

4、度,w1 ,w2是峰1峰2的基线宽度 W0.5,1,w0.5,2是峰1和峰2 的半高峰宽,分离度与k（容量因子）的关系,所以分离的第一步就是控制1k20,或者最好是2k10 方法：有机相100%,90%,80%,70 每减少10%,k值变化为2.53倍,分离度80%-70%-60%,分离度（48%-47%-46%),更换有机相,a :甲醇-水 b:THF-水 c:甲醇：THF:水,总结,1调节有机溶剂比例(10%)使k值可以接受 2 微调有机溶剂比例(1%)，使分离完全 3 更换有机溶剂MeOH,THF,CAN 4 混合使用有机溶剂 记录每一次条件变化对谱峰的影响,其他控制选择性的因素,流动相

5、pH值 柱温 不同品牌色谱柱 离子对试剂,流动相pH值,1,2 酸性化合物 4,5碱性化合物 3中性化合物 图中曲线的拐点为该化合物的pKa pH57之间会有较好的分离，5附近比较稳定,流动相pH值,流动相pH值,pH值的影响(pka),一组苯甲酸(pka=4.2)同系物的分离情况 A: pH 2.5 B: pH 3.0 C: pH 3.5 D: pH 4.0,pH值的影响,pH值必须在该缓冲盐的pKa1以内才有较好作用，超过此范围，会使得色谱条件不稳定，重复性较差 由此得出磷酸盐缓冲液可用于pH 2.0-3.1,6.2.-8.2 醋酸盐缓冲液可用于pH 3.8-5.8,方式不同柱效不同,色谱

6、条件 色谱柱：Kromasil C18 4.6250mm 5um，柱温 ：室温，波长 ： 203nm 流速 ： 1.0ml/min 2.梯度：乙腈：水为流动相 1.流动相：乙腈：水（22：78）为流动相 0min 20 : 80 柱效:11500 20min 40 : 60 人参皂苷Rg1 (样品) 柱效:60000,柱温的影响,温度变化1度，Rt变化13% A: 30 B: 35 C: 40 D: 45 温度控制对定量分析很重要,更换色谱柱的影响,A C8柱 B 苯基柱 C 氰基柱,更换色谱柱的影响,A C8柱 B 苯基柱 C 氰基柱 由于更换色谱柱会影响峰的次序，所以这是最后的选择,流速的

7、影响,A 3um dp B 5um dp C 10um dp 从左到右 1,2,4ml/min 改变流速对分离影响不大，但可以缩短分析时间,填料及外型影响,Dp ：2.5um,3.5um,5um,10um（柱压，理论塔板数） 长度： 20,30,50,100,150,250mm（柱压，理论塔板数） 内径：2.1,3.0,3.9,4.6 mm（线速度）,a 150mm P=1800psi b 250mm P=3000psi,柱长与柱压和RT成比例,改变粒度，长度，流速,150-mm l, 3-m ， 1-mL/min ,1250psi 100-mm , 3-m ，1-mL/min ,825psi

8、 100-mm , 3-m 2-mL/min ,1650psi,缓冲盐（离子强度调节）的影响,色谱柱：Dionex acclaim C18， 5um，250*4.6mm 流动相：CH3CN:(NH4OAc溶液,pH5.2） 20 : 80 检测波长：280nm 流速：1.0ml/min 1050mM浓度,检测器的影响,检测波长的影响,二.色谱条件的开发,色谱条件开发的目标,二高一低：专属性高、准确度高、成本低是一个色谱工作者追求的目标。 在尽量短的保留时间内得到最佳的峰型、合适的分离度。,等度洗脱的特点,优点 操作简单、方便 重现性好 缺点 不适合某些复杂物质,梯度洗脱的特点,优点 分离能力增

9、加 检测灵敏度提高 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式,等度和梯度获得柱效不同,色谱柱： Dionex acclaim C18，250*4.6mm ， 柱温 ：25， 波长 ：203nm 流速 ： 1.0ml/min 样品：人参皂苷Rg1 1.等度：乙腈：水（22：78）为流动相 2.梯度：乙腈：水为流动相 0min 20 : 80 20min 40 : 60,等度和梯度获得柱效不同,柱效2.1万,柱效6万,艰难的选择,分离度 分析时间 系统压力 在三者之间作出最符合实际情况的选择,快速寻找方法的起点,传统的建立方法模式需要较长的时间，100%，90%,现代仪器多为三元或两元泵系统，可以

10、方便的在整个流程中自由的变化比例，因此可以通过探索性梯度运行来寻找最佳方法入口。,确定梯度运行的方法,设计一个30分钟的运行，推荐条件： 250*4.6mm 5um 1.0ml/min 甲醇 0 min 5% 30 100% 35 100%,一个实例,tg 第一个谱峰和最后一个谱峰的时间差 Tg 整个梯度运行时间 tg/tg0.4 梯度 tg/tg=（28.6-18.3)/30=0.34， 因此可以分别尝试,由梯度变换为等度,平均保留时间t=(18.3+28.6)/2=23.5 陡度=(100-5)/30=3.17 等度比例=5+3.17*23.5=79%,等度（79%)运行结果（考虑K?）,

11、由梯度变换梯度(K?),第一个谱峰18.3对应5+3.17*18.3=63% (18.3-2.5)/2.5=6.32,6.32/3=2.1 (K=1) 最后一个谱峰28.6对应5+3.17*28.6=95% 梯度时间为 100-5 =95-42 30 X X=16 min,陡度不变,第二次梯度运行结果,Time B% 0 42 16 95 20 95,液相色谱的方法开发,（二）梯度方法,梯度的洗脱方式,高压梯度及低压梯度,梯度一般方法,梯度洗脱的可变参数,梯度的陡度 梯度的变化形状,如不用梯度：分离不理想,梯度条件的优化,梯度曲线的变化凹线,梯度曲线的变化凸线,梯度方法开发实例 - 第一步,开

12、发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下(0-100% 水-乙腈)，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好。,梯度方法开发实例 - 第二步,为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例（50-100%，水-乙腈），分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的。,梯度方法开发实例 - 第三步,从空白梯度图显示，在同样的色谱条件，同样的检测灵敏度下，共有两个杂质峰。说明流动相水中的杂质在此条件下可能会对检测有影响。,梯度方法开发实例 - 第四步,空白梯度图同样品的色谱图进行对照后，我们看到杂质（共两个峰）中的第一个小峰对第8个色谱峰

13、有干扰，会使其定量分析结果不准确。,梯度方法开发实例 - 第五步,根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前(曲线5，50-100%B)，但是小峰仍没有分出来。,梯度方法开发实例 - 第六步,根据“梯度曲线下的面积越大，洗脱能力越强”的规律，试用#5曲线使3-9号峰提前，改用50-95%B见到好的现象。,梯度方法开发实例 - 第七步,最后用50-90%B，曲线4，得到好的结果。,色谱应用实例欣弗事件,色谱柱： Eclipse XDB-C8 4.6250mm 5um （国家标准） 流动相：(取磷酸二氢钾10.54g，溶于775ml水中，用磷酸调pH值至2.5)

14、-乙腈 检测波长：210nm 柱温：25 流速：1.0ml/min,克林霉素磷酸酯,775225,8218,色谱应用实例欣弗事件,色谱柱： Eclipse XDB-C8 4.6250mm 5um 流动相：(取磷酸二氢钾10.54g，溶于775ml水中，用40%氢氧化钾调pH值至5.6)-乙腈(775225)为流动相 检测波长：210nm 柱温：25 流速：1.0ml/min 分离度大于6,克林霉素磷酸酯,克林霉素,色谱应用实例【三聚氰胺(牛奶事件),色谱柱： Venusil ASB-C18 4.6*250,5um; （FDA标准） 流动相：(10mM 柠檬酸，10mM 辛烷磺酸钠，调pH 为3

15、.0)：乙腈=85：15 检测波长：240nm 柱温：40 流速：1.0ml/min 分 子 式：C3N6H6、 C3N3(NH2)3 分 子 量：126.12 含氮量：66.6%,色谱应用实例（紫杉醇 注射液）,色谱柱：Dionex acclaim C18，250*4.6mm （黄金植物） 流动相：乙腈-水（40：60），洗脱至主峰出完（约27分钟），然后以每分钟1.6%的速度增加乙腈的比例，25分钟后，乙腈比例增至80%，再以每分钟4%的速度降低乙腈的比例，10分钟后，乙腈比例降至40%，保持此比例10分钟。 检测波长：227nm 流速：1.0ml/min,紫杉醇,色谱应用实例（紫杉醇 注

16、射液）,色谱柱：Dionex acclaim C18，250*4.6mm 流动相：甲醇-水-乙腈（30：40：30） 检测波长：227nm 流速：1.0ml/min,炔诺酮,紫杉醇,色谱应用实例（血塞通崩解片）,色谱柱：Dionex acclaim C18，250*4.6mm，波长：203nm 时间（min） 乙腈 水 0 20% 80% 20 40% 60% 21 20% 80% 26 20% 80%,三七皂苷R1,人参皂苷Rg1,人参皂苷Rb1,色谱应用实例（胆酸钠原料）,色谱柱：Dionex acclaim C18，250*4.6mm，波长：205nm 时间（min） 乙腈 0.2%磷酸

17、二氢钾溶液(磷酸调PH值至2.5) 0 25% 75% 30 40% 60% 40 40% 60% 50 25% 75%,指纹图谱,色谱应用实例（抗生素）,色谱柱：Dionex acclaim C18，250*4.6mm，波长：254nm 流动相：乙腈：（三乙胺14ml，加水100ml, 醋酸调PH值至2.5)=18：82 流速：1.0ml/min 样品：注射用头孢哌酮钠,对照品,样品,1.头孢哌酮降解物B 2.头孢哌酮 3.头孢哌酮S异构体,色谱应用实例（酒石酸长春瑞滨原料）,色谱柱：UtimateTM XB-C18 4.6250mm 5um ，波长：267nm 流动相：0.05mol/L磷

18、酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值为4.2)-0.2%癸烷磺酸钠的甲醇 溶液（3367） 柱温：40 流速：1.0ml/min （杂质A+光照）,色谱应用实例（酒石酸长春瑞滨原料）,色谱柱：UtimateTM XB-C18 4.6250mm 5um ，波长：267nm 流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值为4.2)-0.2%癸烷磺酸钠的甲醇 溶液（3367） 柱温：40 流速：1.0ml/min （样品）,色谱应用实例（酒石酸长春瑞滨原料）,色谱柱：UtimateTM XB-C18 4.6250mm 5um ，波长：267nm 流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值为4.2)-0.2%癸烷磺酸钠的甲醇 溶液（3367） 柱温：40 流速：1.0ml/min （中间体+样品）,色谱应用实例（酒石酸长春瑞滨原料）,色谱柱：UtimateTM XB-C18 4.6250mm 5um ，波长：267nm 流动相：0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值为4.2)-0.2%癸烷磺酸钠的甲醇 溶液（3367） 柱温：40 流速：1.0ml/min （样品光照）,色谱应用实例（多糖）,色谱柱：凝胶柱（水相） ，流动相