各论第五章抗菌药物与抗生素类的分析5-15

1、第五章 抗菌药物与抗生素类药物的分析,药物分析学 各论,药物分析教研室 徐新军 E-mail: TEL:39330341教学内容,-内酰胺类,1,2,抗菌药物喹诺酮类,四环素类,3,4,氨基糖苷类,学习要求,掌握,各类药物结构、性质、质量分析特点,有关物质的来源与检查方法,体内样品分析与临床检测,熟悉,了解,第一节 喹诺酮类抗菌药物的分析,一、结构通式,(F),6-氟-4-喹诺酮-3-羧酸,化学合成抗菌药，由于抗菌谱广、抗菌作用强，使用安全，易于制造,得到迅速发展。,代表药物,第一代药物：,第二代药物：,萘啶酸,吡哌酸,哌嗪基,代表药物,第三代药物：,诺氟沙星,环丙沙

2、星,氧氟沙星,*,代表药物,第四代药物：,左氧氟沙星,司帕沙星,加替沙星,莫西沙星,?,左氧氟沙星与氧氟沙星有何区别？,很多药，都是左右旋体的混合物，也就是说50%是有用的，50%是没用的，但两都分子式、性质几乎相同，很难分开，左氧氧沙星就是氧氟沙星里的有用的那50%，因为体内的药物结合位置就是座位一样固定的，如果有人坐了却不干活，效果当然差，如果坐上去就都干活，效果当然好，所以一片左氧比两三片氧氟沙星还要好，以致有人认为是新一代产品。,反应停于20世纪50至60年代初期在全世界广泛使用，它能够有效地阻止女性怀孕早期的呕吐，但也妨碍了孕妇对胎儿的血液供应，导致大量“海豹畸形婴儿”出生。自60年

3、代起，反应停就被禁止作为孕妇止吐药物使用，仅在严格控制下被用于治疗某些癌症、麻疯病等。,从1956年反应停进入市场至1962年撤药，全世界30多个国家和地区(包括我国台湾省)共报告了海豹胎1万余例，各个国家畸形儿的发生率与同期反应停的销售量呈正相关反应停人与动物的一般毒性极低，如服用14克并不使人死亡。但其可选择性地作用于胚胎，对胚胎的毒性明,R-构型具有抑制妊娠反应活性，而S-构型有致畸性。这也加强了人们对手性或者消旋化合物作为药物的认识。而R-构型和S-构型在体内会消旋化，即无论服用哪一种的光学纯化合物，在血清中都发现是消旋的。也就是说即使服用有效地R-构型沙利度胺，依然无法保证其没有毒性

4、。,结构与性质,二、喹诺酮类药物的理化性质,酸碱两性,紫外吸收,旋 光 性,4,1,2,3,一般为类白色或淡黄色结晶,分解反应,5,6,与金属离子反应,（一）两性与溶解性,羧基 弱酸性,氮原子 弱碱性,结构与性质,（二）紫外吸收,结构与性质,（三）旋光性,结构与性质,氧氟沙星,左氧氟沙星,（四）与金属离子络合,结构与性质,与钙、镁、铁、锌等离子形成螯合物 不宜与牛奶等食物或药品同服 长期服用会引起缺铁、缺钙等,三、鉴别试验,与丙二酸反应,A,B,C,D,E,与丙二酸呈色反应,UV法,TLC法,HPLC法,IR法,叔胺基团 棕红-红-紫-蓝,醋酐中,（一） 与丙二酸的反应,鉴别试验,示例 诺氟沙

5、星乳膏的鉴别： 取含量测定项下的供试品溶液5ml，置水浴上蒸干，残渣中加丙二酸约50mg与酸酐1ml，在水浴中加热10分钟，溶液显红棕色。,精密称取本品适量（约相当于诺氟沙星4mg ），置分液漏斗中，加氯仿15ml，振摇后，用氯化钠饱和的0.1 氢氧化钠溶液25、20、20和10ml分次提取，提取液置100ml 量瓶中，加0.1 氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液 ，精密量取续滤液10ml，加0.4 氢氧化钠溶液制成每1ml 中含5g的溶液，照分光光 度法（附录 A），在273nm 的波长处测定吸收度；另精密称取诺氟沙星对照品,叔胺化合物,（二） 紫外可见分光光度法,鉴别试验,示例

6、 左氧氟沙星的UV鉴别： 取供试品适量，加0.1mol/L 盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含5g 的溶液，在226nm与294nm的波长处有最大吸收，在263nm的波长处有最小吸收。,注意鉴别的专属性 !,鉴别试验 (三)TLC法,ChP2010对氧氟沙星、诺氟沙星和氟罗沙星用TLC法鉴别。 氟罗沙星 【示例】取供试品与氟罗沙星对照品适量，加三氯甲烷-甲醇(4:1)制成每1ml含1mg的溶液，分别作为供试品溶液与对照品溶液；另取氟罗沙星对品与氧氟沙星对照品适量，加三氯甲烷-甲醇(4:1)制成每1ml含氟罗沙星1mg和氧氟沙星1mg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液。,吸取上述三种溶液各2l

7、，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨溶液(5:6:2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(254nm)下检视，系统适用性试验应显示两个清晰分离的斑点，供试品溶液所显主斑点的位置和荧光应与对照品溶液主斑点的位置和荧光相同。,ChP2010规定：喹诺酮类药物含量测定项下的供试品主峰应与相应对照品主峰的保留时间一致。ChP2010收载的喹诺酮类药物均采用高效液相色谱法进行鉴别。,鉴别试验 (四)HPLC法,鉴别试验 (五)IR法,盐酸环丙沙星的鉴别：供试品的红外光吸收图谱应与对照的图谱一致。,四、特殊杂质检查,左氧氟沙星光学杂质(右氧氟沙星) 环丙沙星中有关物质的HPLC检

8、查,特殊杂质检查,示例 左氧氟沙星光学杂质(右氧氟沙星)的HPLC检查：,配合交换手性流动相法（HPLC）,色谱条件,1.0mg/ml,10g/ml,0.2mg/ml,各20l,供试品溶液,40,294nm,硫酸铜-D-苯丙氨酸-甲醇(82:18),C18柱,对照品溶液,进样,氧氟沙星对照品,特殊杂质检查,示例 环丙沙星中有关物质的HPLC检查：,五、含量测定,非水 溶液 滴定,紫外法,HPLC法,盐酸洛美沙星 左氧氟沙星,ChP2010吡哌酸的含量采用非水溶液滴定法,ChP2010诺氟沙星 乳膏含量 测定采用UV,含量测定,（一）非水溶液滴定法,示例 吡哌酸含量的非水溶液滴定测定 ： 取供试

9、品约0.2g，精密称定，加冰醋酸20ml溶解后，加结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液显纯蓝色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液(0.1mol/L)相当于30.33mg的C14H17N5O3 。,专属性不强,含量测定,（一）非水溶液滴定法,注意事项 ： 1、严格控制醋酐加入量，并用水分测定法调节至滴定液含水量为0.01%0.2%。否则结果明显偏低。 2、亦可在二甲基甲酰胺溶液中，以麝香草酚蓝为指示剂用甲醇钠标准溶液滴定。,含量测定,（二）紫外分光光度法,示例 诺氟沙星乳膏含量的UV测定 ：,（三）高效液相色谱法,示例 盐酸洛美沙星含量的戊烷磺酸钠离子

10、对HPLC 测定,含量测定 对照品溶液的制备 精密称取在105干燥至恒重的诺氟沙星对照品适量,加氢氧化钠液（0.02mol/L）制备成每1ml中含4g的废液。 供试品溶液的制备精密称取适量（约相当于诺氟沙星4mg）置分液漏斗中，加氯仿15ml，振摇使膏体溶解后，用氢氧化钠液（0.02mol/L）25、20、20与10m（分次提取（每次提取时加饱和氯化钠溶液1ml）收集提取液置100ml量瓶中，用氢氧化钠液（0.02mol/L）稀释至刻度，滤过，弃去初滤液，精精密量取续滤液10ml，置100ml量瓶中，用氢氧化钠液（0.02mol/L）稀释至刻度，摇匀，即得。 测定法 取对照品溶液与供试品溶液，

11、照分光光度法（中国药典1990年版二部附录24页），在273nm的波长处分别测定吸收度，计算，即得。,诺氟沙星乳膏含量的UV测定,示例,离子对色谱 外标法,检测波长,287nm,流动相,戊烷磺酸钠溶液 -甲醇(65:35),供试品溶液,约含洛美沙星 （0.1mg/ml） 20 l,对照品溶液,洛美沙星 （1.0mg/ml） 20 l,C18柱,示例,离子对色谱 外标法,检测波长,294nm,醋酸铵高氯酸钠 溶液-乙腈(85:15),流动相,供试品溶液,供试品约60mg,混合对照溶液,左氧氟沙星0.12mg /ml环丙沙星6g /ml杂质E 6g /ml,C18柱,50ml,取5ml,10l进样

12、,500ml,另取左氧氟沙星对照品适量，同法测定,第二节 -内酰胺类抗生素分析,药物分析,青霉素的发现,第一个用于临床的抗生素 由青霉菌的培养液中分离而得,药物分析,那一年的夏天，弗莱明把细菌培养基放在桌上度假去了。之后恰好有9天的时间天气特别凉爽，于是青霉得以生长，而葡萄球菌则难以生长。然后气温上升，葡萄球菌开始生长，但这时青霉已产生了足够的青霉素来杀死周围的葡萄球菌。弗莱明过完一个月的假期回来后，并没有注意到这个培养基有何异样，而是将它和其他被污染的培养基一起扔进消毒液中。刚好他以前的助手来访，弗莱明为了介绍自己的工作，给他看了几个细菌培养，顺手从准备消毒的一堆培养皿中拿了最上面的还没浸泡

13、的那个来看，这才注意到这一个有些异样。如果弗莱明没有去度长假，如果污染其细菌培养的不是青霉，如果那一段时间的气温没有先凉后热，如果消毒液淹没了培养基，如果他的前同事不是刚好来访，这些环节只要有一个没有发生，这一切就都不会出现了。 发现了青霉的抗菌作用后，他立即想到可以从中开发出抗菌药物。他分离出能抗菌的青霉提取液，把它命名为青霉素，并发现它能抑制多种细菌的生长。1929年弗莱明在英国实验病理学杂志上报道了其发现。,药物分析,青霉素作为一种药物，最终是由牛津大学的霍华德弗洛里实验室开发出来的。1938年，犹太人恩斯特钱恩逃离纳粹德国到了英国，在弗洛里实验室工作，其课题是研究天然抗菌物质，他读到了

14、弗莱明1929年的论文，立即很感兴趣。他设法提取出了一些相对比较纯的青霉素，想用它在老鼠身上试一试。但是钱恩是个生物化学家，没有资格做动物试验，几次向弗洛里提出试验要求，弗洛里都很冷淡。后来，钱恩趁弗洛里不在，找一个同事帮忙，给两只被细菌感染的老鼠注射了青霉素。两只老鼠都康复。弗洛里获悉实验结果后，才对青霉素发生了兴趣。在他的领导下，组织了一支强大的研发队伍，生产出更多、更稳定的青霉素，开始了人体试验，并在美国进行大规模的生产。生产出来的青霉素首先被用于拯救盟军受伤战士，避免因受伤感染导致的死亡，据估计，青霉素救了12%-15战士的生命。战争结束后，青霉素即转为民用。 1945年，弗莱明、弗洛

15、里、钱恩三人分享诺贝尔医学奖。但是一般人都只知道弗莱明发现了青霉素，不知道青霉素能从实验室走向临床、变成救人无数的良药，主要得归功于钱恩和弗洛里。（青蒿素的发现）,药物分析,药物分析,抗生素类发展史,1929年，弗来明(Alexander Fleming) 发现青霉素。 1958年谢汉合成6-氨基青霉烷酸(6-APA)成功。开创了半合成青霉素的时代 1961年，头孢菌素C被发现，头孢菌素迅速发展。 80年代:广谱碳青霉烯类上市。,药物分析,药物分析,细心与协作精神的胜利,青霉素的发现始于一个现象的意外观察，而我唯一的功劳仅是没有忽视观察。 A. leming,药物分析,细心与协作精神的胜利,化

16、学家和经过生物学训练或具有生物学知识的行家之间的合作是非常关键之处，这也是在此之前对大批已知抑制剂的研究成果甚少的原因之所在。 Florey,第二节 -内酰胺类抗生素,青霉素类,头孢菌素类,青霉素类 (penicillins),母核为6-氨基青霉烷酸 (6-Aminopenicillanic Acid，6-APA),A,B,1,2,3,4,5,6,7,头孢菌素类(cephalosporins),母核称为7-氨基头孢菌烷酸 (7-Aminocephalosporanic Acid，7-ACA),A,B,1,2,3,5,6,7,8,4,青霉素,代表药物,氨苄西林（氨苄青霉素）,代表药物,阿莫西林（

17、羟氨苄青霉素）,代表药物,头孢氨苄,代表药物,头孢拉定,代表药物,头孢氨苄,头孢拉定,头孢羟氨苄,代表药物,头孢噻吩钠,代表药物,结构特点与性质,青霉素类,头孢菌素类,（一）羧基：酸性,（青霉素钾、钠）,结构特点与性质,（一）羧基：酸性,结构特点与性质,与有机碱(普鲁卡因)成盐：难溶于水,普鲁卡因青霉素,头孢菌素类,青霉素类,（二）手性碳原子：旋光性,结构特点与性质,（二）手性碳原子：旋光性,结构特点与性质,阿莫西林,（二）手性碳原子：旋光性,结构特点与性质,头孢克洛,头孢菌素类,青霉素类,（三）共轭体系：UV,结构特点与性质,母核无吸收； 苯环取代基有UV,母核、苯环取代基均有UV,青霉素钠

18、UV7-20,头孢菌素类,青霉素类,（四）-内酰胺环,结构特点与性质,青霉素类,（某些金属离子） （温度）,某些氧化剂 酸、碱、青霉素酶,青霉素,青霉噻唑酸,H2O/OH,青霉素酶,青霉酸,H2O,pH2,100,青霉噻唑酰基羟胺酸,NH2OH,青霉烯酸,pH4,青霉胺,CO2,青霉醛,HgCl2,1、TLC法,2、HPLC法,二、鉴别试验,（一）色谱法：对照品对照法,1、IR法,鉴别试验,（二）光谱法,2、UV法,鉴别试验,（二）光谱法,Cu2+,头孢唑啉钠 max = 272nm,（1）样品的最大吸收波长,Cu2+,头孢氨苄 max = 262nm,青霉素V钠 A280nm/A264nm

19、= 1.301.50,（2）分解产物的最大吸收波长,2、类似肽键的反应,鉴别试验,（三）呈色反应：,酚羟基,3、其他呈色反应,1、羟肟酸铁反应,羟肟酸铁反应,鉴别试验,（三）呈色反应,鉴别试验,（四）各种盐的反应,1.聚合物：分子排阻色谱法 2.有关物质和异构体：色谱法 3.杂质含量：吸光度 4.有机溶剂： GC法 5.结晶性：,三、检查,四、含量测定,（三）含量测定1、微生物检定法,定义：以抗生素对微生物的杀伤或抑菌程度为指标来衡量抗生素效价。 测定方法：分为稀释法、比浊法和管碟琼脂扩散法。 优点：灵敏度高、需用量少，测定结果较直观。测定原理与临床应用一致，适用范围广。是抗生素测定的基本方法

20、。 缺点：操作步骤多，测定时间长，误差大。常用于多组分或结构复杂抗生素。,是利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品二者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。在一定范围内，抗生素溶液的对数浓度（剂量）与抑菌圈面积或直径成正比，根据抑菌圈的大小计算出抗生素溶液的浓度。,管碟法又称管碟琼脂扩散法,Size of Cylinder Cup,T2,S1,S2,T1,管碟法,1.加注底层培养基 2 加注培养基菌层 3. 放置小钢管 4. 滴加抗生素溶液 5. 双碟中菌株的培养 6. 抑菌圈测量,2、理化方法,根据抗生素的分子结构特点，利用其特有的化学或物理化学性质及反

21、应而进行的。 优点：对于提纯的产品以及化学结构已确定的抗生素，能较迅速、准确地测定其效价，具较高专属性。 缺点：对含有同样官能团杂质的供试品不适用。不一定代表生物效价。,3、抗生素活性表示方法,以效价表示，即指每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。用u/mL或g/mg表示。 举例1：1mg青霉素钠定为1670单位,则1mg青霉素钾的效价 1670X356.4/372.5=1598u/mg (青霉素/青霉素钠):1670=(青霉素/青霉素钾):X 举例2：,青霉素V钾,链霉素 双氢链霉素 新霉素 卡那霉素 庆大霉素 巴龙霉素,第三节 氨基糖苷类抗生素,一、结构分析与代表药物,链霉双糖胺

22、,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L- 葡萄糖胺,链霉素,D-葡萄糖胺 + 脱氧链霉胺 + D-核糖 + 巴龙霉糖,巴龙胺 巴龙二糖胺,巴龙霉素,巴龙霉素,巴龙霉素I R1=CH2NH2 R2=H 巴龙霉素II R1=H R2=CH2NH2,绛红糖胺,2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,庆大霉素,庆大霉素,庆大霉素C1 R=H R1=R2=CH3 庆大霉素C2 R=R2=H R1=CH3 庆大霉素C1a R=R1=R2=H 庆大霉素C2a R=CH3 R1= R2=H,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L- 葡萄糖胺,链霉素,巴龙霉素,巴龙霉素I R1=CH2NH2 R2=H 巴龙霉素II R1=H R2=CH2NH

23、2,绛红糖胺,2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,庆大霉素,多与硫酸成盐,链霉素 3个,庆大霉素 5个,碱性中心,（一）碱性,水溶性,（二）溶解性,巴龙霉素 4个,二、结构与性质,链霉素 pH5.07.5 庆大霉素 pH2.012.0,稳定,（三）稳定性,结构与性质,（四）UV,链霉素：230nm,（五）旋光性,硫酸庆大霉素：+107至 +121,硫酸巴龙霉素：+50至 +55（右旋）,结构与性质,三、鉴别试验,链霉胍特有反应,链霉糖特有反应,羟基胺结构,（一）茚三酮反应,鉴别试验,（二）Molisch反应,氨基糖苷类 抗生素,糠醛或 羟甲基糠醛,H+,呈色,鉴别试验,具五碳糖或六碳糖结构的氨基糖苷类经

24、 酸水解后，在酸作用下脱水生成糠醛 （五碳糖）或甲基糠醛，这些产物遇-萘酚 或蒽酮呈色。 -萘酚呈色 红紫色 蒽酮呈色 蓝紫色,（三） N-甲基葡萄糖胺反应,吡咯衍生物,樱桃红色,（Elson-Morgan反应）,氨基糖苷类 抗生素,葡萄糖胺衍生物,鉴别试验,（四）麦芽酚反应,链霉素特征反应,H+,分子重排,鉴别试验,麦芽酚,链霉胍特有反应,（五）坂口反应,（或-萘酚）,鉴别试验,H+,（六）硫酸盐反应,（七）色谱法,1、TLC法： 2、HPLC法,鉴别试验,（一）有关物质检查,链霉素B（甘露糖链霉素）,方法 TLC中的对照品法,1. 来源 发酵产物,四、有关物质及组分分析,（二）组分测定,有

25、关物质及组分分析,对微生物的活性无明显差异,毒副作用和耐药性不同,发酵菌种不同 工艺差别,C组分比例 不一致,规定控制各组分的相对百分含量,2、计算：峰面积归一化法,1、测定：HPLC,有关物质及组分分析,蒸发光散射、衍生化法,max = 330nm,衍生化原理,1、,2、蒸发光散射检测器(ELSD) 2005年版药典,ChP2000年版,1-烷基硫代-2-烷基 异吲哚衍生物,规定 C1 2550% C1a 1540% C2a +C2 2050%,ChP2010：蒸发光散射检测,有关物质及组分分析,固定相：十八烷基硅烷键合硅胶 流动相：0.2mol/L三氟醋酸-甲醇(928) 检测器：蒸发光散

26、射检测器,规定 C1 2550% C1a 1035% C2a +C2 2555%,USP35-NF30：衍生化紫外检测,有关物质及组分分析,固定相：十八烷基硅烷键合硅胶 流动相：0.7%1-庚烷磺酸钠甲醇-水-冰醋酸 (70:25:5) 检测器：紫外检测器（330nm）,规定 C1 2040% C1a 1030% C2b + C2a +C2 4060%,BP2010：柱后衍生化电化学检测,有关物质及组分分析,固定相：苯乙烯-二乙烯苯共聚物 流动相：无二氧化碳的水配制备的60g/L无水硫酸 钠，1.75g/L 1-辛基磺酸钠，8ml/L四氢呋 喃，50 ml/L 0.2mol/LM磷酸二氢钾,p

27、H3.0 检测器：脉冲安培检测器,微生物检定法,HPLC法,五、含量测定,A,B,C,D,第四节 四环素类抗生素,一、结构分析与代表药物,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,第四节 四环素类抗生素,四环素类代表药物,四环素（TC）tetracycline,金霉素 (CTC)氯四环素；chlortetracycline,四环素类代表药物,土霉素 (OTC)氧四环素oxytetracycline,四环素类代表药物,多西环素 (DOXC)脱氧土霉素；doxycycline,四环素类代表药物,美他环素（METC） metacycline,四环素类代表药物,二、结构与性质,（一）两性,酚羟基、烯醇型羟基 弱酸性,二甲胺基 弱碱性,结构与性质,（二）旋光性,结构与性质,盐酸土霉素： -188-200 盐酸四环素： -240-258 盐酸多西环素：-105-120,（三）紫外吸收,结构与性质,盐酸多西环素: 269; 353nm (max) 234; 296nm (min ),盐酸美他环素： 345; 282; 353nm(max) 264; 222nm(min),盐酸金霉素,（四）荧光吸收,结构与性质,绿色,绿色,盐酸土霉素,盐酸四环素,蓝色,蓝色,黄色,（五）不稳定