分子生物学-12-1-第六章 基因功能研究方法-1

1、山西师范大学教案 课程名称：分子生物学课程类型： 理论课 理论、实践课 实践课学 时： 52 学 分： 2 授课教师：郜刚授课班级：授课学期：20 至20 学年第 学期教材名称：朱玉贤 分子生物学3rd参考资料：1Benjamin Lewin Genes VIII2：英 P.C.特纳 A.G.麦克伦南 A.D.贝茨 M.R.H.怀特 Instant Notes in Molecular Biology3 韦弗（Robert FWeaver）Molecular Biology第六章 基因功能研究技术6.1 转录组测序什么是转录组？ 某生物某特定生理条件下某个细胞或者组织中全部RNA；特指全部mR

2、NA.转录组研究的方法传统方法（基于Sanger 测序技术的）：表达序列标签 expressed sequence tag,EST基因表达序列分析 Serial Analysis of Gene Expression, SAGE新方法（基于新测序技术的） 454, solexa, SOLiD5.6蛋白质组学的研究方法和进展page1876.1 基因表达研究技术6.1.1 基因表达系列分析技术特点： SAGE是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。原理：任何长度超过9-10个碱基的核 苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产 物，因此，将这些9-10碱基序列作为该转录物的标签，根据这个标

3、签占总转录物的比例 可分析所对应基因的表达频率应用：干什么的？一个细胞中到底有多少种基因在表达基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE)定义 是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法。分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签（约9-14个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应基因的表达丰度。SAGE是一种同时检测许多基因在同一时间、同一细胞中的表达及其水平的一种方法。其理论依据在于“cDNA的同一种限制性内切酶位点旁边的9核苷酸序列可以作为代表一种cDNA的标签”。因为，几乎不可能有两个

4、基因cDNA的同一个酶切位点旁边的9个核苷酸完全相同，也就是说，相同的9核苷酸同时出现的概率是1/491/262144，而细胞中表达基因的数目远小于这个数。 所以当检测到细胞中有多少种9核苷酸序列时，就可以判定有多少基因在表达，其表达产物的多少就反映了其表达水平的高低。6.1.2 RT-PCR法研究RNA的选择性剪接RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。平衡剪切5选择性剪切3选择性剪切外显子遗漏型剪切相互排斥性剪切。RT-PCR法可以研究某个基因是否存在选择性剪切。6.1.3原位杂交in situ hybridization原位杂交（I

5、SH）是 用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射 检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体 上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段.先经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。检测基因表达的常用RNA和染色体原位杂交两大类。RNA原位杂交:用放射性或非放射性（如地高 辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基 因的表达产物做出定性定量分析。荧光原位杂交（fluoresc

6、ence in situ hybridization, FISH)FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，来确定该DNA序列在染色体上的位置。6.1.4 基因定点突变技术概念：通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列作用：用于研究基因产物功

7、能：氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响改造DNA调控元件特征序列修饰表达载体引入新的酶切位点定点突变的方法1、经典的寡核苷酸介导的定点突变2、PCR介导的定点突变方 法 重叠延伸PCR技术 大引物诱变法经典的寡核苷酸介导的定点突变重叠延伸PCR介导的定点突变原理：PCR设计引物时，允许有个别碱基错配，也能退火。特点：可以定一个点的突变，也可以同时定两个点的突变注意：教材上199页图6-7是错误的，文字描述也有问题重叠延伸单点定点突变大引物诱变法原理1：两条或者多条不同的引物存在时，可以通过控制某一个引物的退火温度来控制其为优势PCR原理2：用第一次PCR的产物（较大的片段

8、）作为第二次PCR的引物6.2 基因敲除技术6.2.1 基本原理经典遗传学（Forward genetics）是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而 找出该基因的编码序列。反向遗传学（Reverse genetics）首先从基因序列出发，推测其表现型， 进而推导出该基因的功能。基因敲除（gene knock-out）又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。基因打靶技术常被用于灭活单个基因，又称为基因敲出。科学家由此可以确定单个基因在健康和疾病中的角色。这种基因“敲除”试验已经阐明了胚

9、胎发育、成人生理学、衰老和疾病中无数个基因的角色。目前已经有一万多个小鼠基因被敲除（大约为哺乳动物的基因组的一半）。正在进行的国际性研究很快将能够实现所有小鼠基因的敲除。 基本原理1：同源重组基本原理2：胚胎干细胞转基因动物2. 基因功能的研究方法（1）转基因技术：导入细胞，观察功能。该方法用的最多，技术最成熟。（2）基因敲除技术（gene knock-out/down 又称基因打靶（gene targeting）。这种技术是通过基因工程的方法将一个结构已知但功能未知的基因去除，或用其他序列相近的基因取代（又称基因敲入），然后从整体观察实验动物，从而推测相应基因的功能。这种人为地把实验动物某一

10、种有功能的基因完全缺失的技术称为基因敲除技术。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除ES细胞或者动物个体中的靶基因活性。条件型基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。具有发育的组织特异性。gene knock-out的意义： 研究基因功能 转基因动物的制备 用于药物筛选的动物模型 转基因动物可作为“生物反应器”生产药物（3）基因敲入技术（gene knock-in) 利用基因同源重组，将有功能的外源基因转入基因组中不存在或已失活的同源序列进行同源重组，在细胞内获得表达，这一技术称为基因敲进。附录：1 转基因技术相关概念1.转基因：在DNA操作过程中整合到宿主细胞

11、染色体上的外源基因 转基因技术包括下列： 转基因的重组子构建技术 重组分子导入宿主休内的转化技术 转基因在受体细胞染色体上的稳定整合 转基因的可控性表达技术 2.转基因生物品（GMO或TO）：含有转基因并为其遗传修饰了的动 植物发育个体一般的转基因方法电穿孔法显微注射法脂质载体包埋法裸露DNA直接注射磷酸钙DNA共沉淀法病毒介导的生物学方法转基因动物的制作方法一、受精卵雄原核显微注射法二、胚胎干细胞（ES细胞）法三、逆转录病毒感染法四、体细胞核移植法五、精子载体法六、YAC法转基因植物方法概括起来说主要有两类：第一类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移系统法。第二类是外源目的DNA的直接转化。农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或 Ri质