分子生物学-11-1-第五章基因克隆技术

1、 第5章：研究方法-基因克隆 导言：克隆技术 克隆的现代含义 基因克隆 基因克隆策略 基因克隆相关技术 Clone 翻译过来 克隆 “Clone”起源于希腊文“Klone”，原意： 用“嫩枝”或“插条”繁殖。 最初意义 无性繁殖 现代意义 两个词性、三层含义 动词，通过某种操作比如显微操作、分子生 物学操作来获得与某种祖先相同的分子、 细胞、个体的过程。 名词，通过上述操作获得的遗传上与祖先相 同的分子、细胞、个体。 5.5基因文库的筛选 当作名词时，克隆是指由遗传组成完全相同的分子、细胞或个体组成的一个群体。例如， DNA分子克隆或基因克隆是指核苷酸序列相同的一群DNA分子或基因拷贝； 细胞

2、克隆则是来源于同一祖细胞的、基因型完全相同的一群子细胞； 个体克隆则是指基因型相同的个体的拷贝。 当作动词是指运用DNA重组技术将一个特定的基因或DNA序列输入一个载体分子；也指分离出单个分子、基因或细胞后使之增殖成一个群体，当然也包括复制个体的一系列实验操作。 在分子生物学中特指基因克隆（gene cloning） 指的是从基因组中把某个基因分离出来，再把它重组在合适的载体上，使之增殖成许多拷贝的过程。 这里面含有几层意思： 1、要知道这个基因的序列如何； 2、要搞清楚这个基因位于基因组那条染色体上，位置关系如何； 3、要把这个基因的序列放置在某种载体分子上以便能够获得它的多个拷贝。 5.5

3、 基因克隆（gene cloning） 指的是从基因组中把某个基因分离出来，再把它重组在合适的载体上，使之增殖成许多拷贝的过程。 基因克隆（gene cloning）是指某种目的基因的分离过程，通常是从基因组或DNA大片段中分离并获得某一特定的基因或DNA片段，再通过DNA 序列扩增形成由众多拷贝组成的DNA拷贝群体的过程。 几层意思： 1、要知道这个基因的序列如何； 2、要搞清楚这个基因位于基因组那条染色体上，位置关系如何； 3、把这个基因的序列放置在某种载体分子上以便能够获得它的多个拷贝 基因克隆的一般策略 1 已知序列基因的克隆 概述： 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种

4、。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。 现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accessionnumber),以便别人参考和查询 已知序列的来源 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accessi

5、on number),以便别人参考和查询。 目前,世界上主要的基因库有: (1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为http:/www.ebi.ac.uk/ebi-home.html; (2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为/web/search/index.html; (3)Swissport和TREMBL, Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。 目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的

6、,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。 查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。 2 表型或功能克隆 1、定义 表型克隆（phenotypic cloning）或者称为功能克隆（functional cloning）、差异基因克隆。 从功能出发，利用特定组织细胞器官与正常组织细胞器官DNA或RNA水平上的差异，进行相关基因的分离与克隆，这些基因表达变化是与

7、可检测的表型变化直接联系的，故称为表型克隆，这些表型变化又是与某种生理功能紧密相关的，所以又称为功能克隆。 产物已知基因的功能克隆方法 （适用于产物和功能已知的基因） 寻找表型异常 找出导致表型异常的 异常功能蛋白质 根据氨基酸序列推导DNA序列 以此为探针 筛查基因文库或cDNA文库 克隆这种异常蛋白质的编码基因 产物序列未知基因的功能克隆方法 （适用于功能已知、产物未知的基因） mRNA差异展示（mRNA differential display,DDRT-PCR） 代表性差示分析（representational difference analysis,RDA） 抑制性差减杂交（supp

8、ression subtractive hybridization,SSH） 差异消减展示（differential subtraction display,DSD） 5.5.1 RACE技术 (rapid-amplification of cDNA ends) 5 RACE 3 RACE classic RACE The SMART RACE: Switching Mechanism At 5 end of RNA Transcript. The Takala RACE 经典的RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 主要通过RT-PCR技术由已知部分c

9、DNA序列来得到完整的cDNA5和3端，包括单边PCR和锚定PCR。 完整的cDNA 序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。 特点：从一个相同的cDNA模板进行5和3末端快速克隆的方法。 首要条件： 至少获得mRNA的2328个核苷酸序列信息，以此来设计5末端和3末端RACE反应的基因特异性引物（gene specific primer，GSP） 克隆目标cDNA全长3种情况，3种策略 5 RACE(通常用于已知3求5) 1 利用已知基因片段，设计基因特异的引物GSP1，在反转录酶的作用下，合成cDNA第一链； 2 用RNAase H降解杂合链中的mRNA， 3 末端转移酶在第一链cDNA

10、3端增加oligodC， 4 针对oligodC 设计锚定引物，以第一链cDNA为模板扩增出5端 3 RACE(通常用于已知5 求3) 1 利用已知基因片段3末端的polyA，设计锚定引物oligodT（引物3端增加两个兼并引物），在反转录酶的作用下，合成cDNA第一链； 2 用RNAase H降解杂合链中的mRNA， 3 利用基因特异的引物GSP和锚定引物进行PCR 5.5.2 cDNA差示分析法克隆基因 前提：利用两套cDNA：tester和driver，其中tester中含有少数dirver中不具有的cDNA即差异基因，除此之外，二者完全相同。 原理1：利用差减杂交，去除相同的部分 原理

11、2：利用增加接头的方法，特异指示tester， 原理3：利用PCR的指数扩增，筛选差异基因 cDNA差示分析法克隆基因-RDA RDA法充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板，而以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增了目的基因片段。 因为试验对象（Tester）和供试探针（Driver）在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群（representation），保证绝大部分遗传信息能被扩增。 每次T减D反应中两者物质的量比就要求达到1：100或更高，经过2-3次重复，T群体非特异性序列几乎没有偶然逃脱的

12、可能性。 5.3.3 Gateway大规模克隆技术（了解） 说明：gateway并不是上述克隆基因的技术，而只是一种大规模将目的基因从克隆载体转向表达载体的方法 两步完成： TOPO反应：PCR产物连入Entry载体 LR反应：PCR产物从Entry载体重组入表达载体 5.5.4基因的图位克隆 （map-based cloning or Positional cloning ） 根据遗传连锁分析和染色体步移法，将基因定位到染色体的一个具体位置上，通过筛选基因组文库来克隆基因。 定位克隆的核心是连锁分析技术 连锁分析即通过基因与基因之间的重组系数来估计这两者之间的距离,若某种性状的基因与另外一个

13、基因在子代不分离,即有连锁在一起的趋势。根据已知基因的染色体位置来判断未知的连锁基因的染色体位置。 但是已知的基因与未知基因存在连锁关系的并不多,所以连锁分析对克隆大多数基因存在着一定的困难。 RFLP等分子标记的出现使多态性基因标记存在于整个基因组内,解决了连锁分析中难以克服的困难。 寻找连锁基因就转变成了寻找连锁标记。 定位克隆的前提条件 1、建立相应的文库， 例如BAC、YAC库。 2、要有合适的与目的基因紧密连锁的分子标记做筛库的探针。 基因定位克隆步骤（map-based cloning） (用于分离其编码产物未知的基因，理论上任何一个有突变的基因都可以通过这种方法克隆出来) （1）

14、根据突变通过家系分析等将基因定位在染色体上，并在目的基因两侧确定一对紧密连锁的分子标记（RFLP等）； （2）利用这对分子标记作探针，通过染色体步移(chromosome walking) 技术或者染色体显微切割技术将位于这两个分子标记之间的含有目的基因的基因组片段克隆并分离出来； （3）确定含有目的基因的染色体片断，也就是再进一步做出更精细的染色体图谱； （4）最后在这些片段中进一步筛选目的基因，并作突变检测验证和功能分析（一般是通过遗传互补完成） 染色体步移法图示 Chromosome walking 染色体步移的起点是具有一个与待分离的目的基因尽可能靠近的已经鉴定的分子标记。这种标记可以

15、是RFLP，也可以是已知的基因克隆。 先构建起点RFLP标记克隆的限制图，并把其中最靠近目的基因的限制片段亚克隆出来。此限制片段经放射性同位素标记之后，用作分子杂交探针，从基因组文库中筛选与起点克隆具有重叠序列的新克隆（称之为一步克隆）。重复进行上述的各个步骤。构建一步克隆的限制图，亚克隆其中最靠近目的基因的限制片段，该片段经放射性同位素标记之后，用作分子杂交探针从基因组文库中筛选与一步克隆具有重复序列的新克隆（称之为二步克隆）。如此重复进行多次，每得到一个新的克隆都更接近目的基因一步，直至最后获得了目的基因的克隆。由于这种技术是通过逐一克隆来自染色体基因组DNA的彼此重叠的序列，而慢慢靠近目的基因