Realtime PCR检测原理和问题处理

1、real-time pcr检测技术原理和问题处理,2014-06-25,实时荧光定量pcr检测技术（real-time pcr),荧光定量pcr（realtime fluores-cence quantitative pcr,rtfq pcr)是1996年由美国applied biosystems 公司推出的一种新定量实验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对pcr产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。,什么是pcr？,pcr的反应过程,rt-pcr原理图,阈值,阈值= 基线（背景）信号的标准偏差的10倍，即 pcr扩

2、增信号进入相对稳定对数增长的最下限，通常设定在s型扩增曲线的增长拐点处附近。,ct值,扩增反应中，当荧光信号增长到大于阈值时所对应的循环数，即pcr增长信号与 threshold发生交汇的循环数，也是fq-pcr判断阴阳性和进行定量分析的依据。,dna0,确定初始模板的浓度 初始dna量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少 log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量,real-time pcr动力学曲线和四个阶段,只有在荧光信号指数扩增阶段， pcr 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。 pc

3、r理论方程只在指数期成立。,pcr产物的量与扩增循环数间的理论方程,rn = rb + x0 (1+ e)n rs rn :第n次pcr循环时的荧光信号强度 rb :背景信号强度 x0 (1+ e)n rs :每个分子的荧光强度与分子数目的乘积 经过一系列移项、取对数等复杂数学公式变换： 得到：ct = k lg x0 + b 线性方程， lg x0 越大，则ct值越小！,从荧光信号实现定量结果 一、检测荧光信号增长，获取样品ct值,从荧光信号实现定量结果 二、绘制标准曲线,从荧光信号实现定量结果 三、以待测样品的ct值对dna0作图，得到定量结果,定量pcr的数学原理 定量pcr的化学原理

4、定量pcr的光学原理,常用的荧光标记方法,1、dna双链特异性染料 sybr green 、syto 9、lc green、evagreen 2、序列特异性探针 taqman 、molecular beacons（分子信标）、dual probes (fret)、lna(locked nucleic acid) double-dye probes,sybr green i 工作原理,1、每形成一个dna双链，就有一定数量的染料结合上去 2、染料一结合，就产生荧光信号 3、信号强度与dna分子总数目成正比,sybr green i工作原理图片演示,熔解曲线(dissociation curve)

5、,目的：在pcr之后分析产物特异性 基本程序： -解链； -复性； -升温检测； -降温； 软件自动分析,融解曲线(dissociation curve),pcr双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。 tm值：50%dna变成单链时所需要的温度，此温度与双链dna的长度、gc含量有关，可部分代表产物序列的特异性； pcr反应完成后，控制体系温度缓慢升高，双链dna解链成为单链dna，sybr green被释放，荧光信号逐渐减弱； 当体系到达某一特定温度时，某些dna双链会突然完全解离，荧光强度也显著减弱； 对融解曲线求一阶导数，峰值代表斜率改变最大值，该处所对应的横坐标值（温度

6、），即tm,融解曲线(dissociation curve),pcr双链产物荧光强度与温度的函数图，用于确认产物的特异性。,原始图谱,导数图谱,只有染料法才需要做熔解曲线，探针法没必要。,sybr green i的优缺点,成本低 不需要制备序列特异的针对性探针，且试剂便宜 适合初步筛查 先用sybr筛查，再对少数关键样品用探针法确认 配合熔解曲线分析 需鉴定pcr反应是否有杂带、引物二聚体 特异性问题 不能分辨主带与杂带，给出所有双链dna的总信号 多重定量问题 每个pcr管只能检测一个目标基因,taqman原理,taqman荧光定量技术是以taqman荧光探针为基础，taqman荧光探针为一

7、寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；pcr扩增时，taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条dna链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与pcr产物形成完全同步，从而实现定量。,taqman探针的作用机理,taqman探针,优点 灵敏、特异性高： 每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，实时检测特异扩增片断，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性 有多种不同波长的荧光基团对可供选择，可以实现在同一管内检测多重pcr，降低成

8、本也提高效率和准确性 避免了荧光染料对pcr反应的影响 缺点 探针设计有一定难度，需要验证效果 探针合成质量对试验结果有较大影响 荧光标记成本较高,多重检测,原理 同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因 不同的探针识别不同的靶基因 不同的荧光报告基团标记不同的探针 目的 提高效率，节省时间 降低研究成本 特点 一次提取dna/rna、一次反应、定量多个基因 要保证信号之间互不干扰,常用的荧光染料,定量pcr的数学原理 定量pcr的化学原理 定量pcr的光学原理,荧光pcr区别于其他pcr方法主要有以下优点,1) 全封闭反应，无需pcr后处理 2) 特异性强，灵敏度高 3) 采用对数期分析，摒

9、弃终点数据，定量准确 4) 定量范围宽，可达到10个数量级 5) 仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断 6) 可实现一管双检或多检7) 操作安全，缩短时间，提高效率 8) 利于自动化和联网管理,定量pcr常见问题处理,扩增曲线-amplification plot,标准曲线-standard curve,原始数据-component,各波长的原始信号-spectra,融解曲线-dissociation,定量pcr实验中的10个常见缺陷,1.引物或探针的设计不过关 2.rna模板质量差 3.没有使用“预混液”，导致差异的累积 4.发生污染 5.没有使用无逆转录酶的阴性对照，排除基因组dna

10、的干扰 6.选取了不恰当的“内参基因” 7.在使用sybr green染料的实验中，没有引入“融解曲线分析” 8.没有正确设置“基线”和“阈值线” 9.反应体系“扩增效率”低下 10.标准曲线的范围没有涵盖样品量的变化,导致异常实验数据的常见原因,错误的荧光染料设置 错误的反应程序设置 荧光污染 反应试剂质量问题 仪器硬件问题 未正确密封而导致的试剂蒸发,实例1：没有标准曲线,标准品没有填写相应的数值,实例2：没有扩增曲线,原因1：pcr参数设置错误 数据收集步骤只有一个循环，只收集了一个数据点。,实例2：没有扩增曲线,原因2：硬盘休眠，数据采集中断,实例3：基线下滑,从原始数据找原因 1-9

11、循环，rox的信号下降 基线设定4-13范围内，rox信号值变化，fam的信号值基本固定；fam/rox的校正后，基线不是水平的直线； 应该取rox信号稳定的10-20循环为合理的基线范围。,实例3：基线下滑,修改基线范围为10-20，重新分析,实例3：基线下滑,基线范围取10-20循环的数据，重新分析后的图谱,实例4：扩增曲线弯曲,原因：基线设置的终点大于样品ct值。通常是因为模板dna浓度过高，若ct值 15，而基线范围仍然取3-15其中基线荧光包含部分扩增信号，导致标准差偏大，阈值设定过高。 解决方案：减小基线终点设置至最小ct值前4个循环，重新分析数据。,实例4：扩增曲线弯曲,原因：样

12、品浓度跨度太大，有的样品浓度太高，在同一基线设置情况下，会导致ct值太小（小于基线右侧）的样品的曲线在右侧下跌。 解决方案：对于能检测出ct的样品，读出数据；浓度太高的样品，需稀释后另做实验。,实例5-1：直线扩增曲线,部分探针降解后，部分报告荧光基团从探针上脱落 导致：基线抬高；扩增与荧光信号的增加不一致。,实例5-2：直线扩增曲线,扩增曲线是一根水平直线 说明没有检测到信号，提示实验失败,实例6：非特异性扩增,sybr green i 实验，dissociation curve分析,推荐措施：提高引物设计质量，避免形成引物二聚体 补救措施：优化引物浓度和退火温度，专设高温度的收集信号步骤,实例7：重复性不佳,正常的原始数据,实例7：重复性不佳,不正常的原始数据,原因：盖子未盖紧，溶液蒸发。,疾病监测中常用的反应mix,abi公司 agpath-id