作物青枯病LAMP检测技术规程（征求意见稿）

1、ICS点击此处添加中国标准文献分类号DB江西省地方标准DB 36/ XXXXXXXXX作物青枯病LAMP检测技术规程Techniquely Rules for LAMP Detection on Tuber Crops Bacterial WiltRalstonia solanacearum (Smith)点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施江西省市场监督管理局发布DB36/ XXXXXXXXX目次前言II11术语和定义12样品采集13样品处理24LAMP反应25LAMP检测结果判断2附录A（资料性附录）LAMP检测引物、5LA

2、MP混合引物配制及反应体系和条件3前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由江西省农业农村厅提出并归口。本标准起草单位：江西省农业科学院植物保护研究所、江西生物科技职业学院、江西省植保植检站。本标准主要起草人：李信申、曾荣、华菊玲、黄小梅、陈建、黄瑞荣、黄建华、王希。4作物青枯病LAMP检测技术规程范围本标准规定了马铃薯、甘薯、芝麻、花生、烟草及茄科蔬菜等作物青枯病（bacterial wilt）的LAMP检测技术。本标准适用于马铃薯、甘薯、芝麻、花生、烟草及茄科蔬菜等作物青枯病LAMP检测。1术语和定义下列术语和定义适用于本标准。 1.1LAMP扩增技术 Loop-me

3、diated isothermal amplification环介导等温扩增技术（简称LAMP扩增技术）是一种可于特定恒温条件下，实现短时间内对靶标序列高效扩增的技术。检测结果通过肉眼观察绿色荧光的生成进行判断。该技术具有“简便、快速、精确、低价”的特点。已广泛用于病害的诊断及病原菌的定性定量检测。1.2引物 primer 指一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。1.3 反应体系LAMP反应体系主要要素为：外引物、内引物、dNTP、Bst 2.0 DNA聚合酶、10Thermo Pol buffer缓冲液、M

4、gSO4、Mncl2、甜菜碱、模板和钙黄绿素。在恒温条件下，Bst 2.0 DNA聚合酶通过链置换催化靶基因片段合成；而反应体系中的染料与Mn2+结合发生颜色变化，达到可视化目的。2 样品采集将新鲜的疑似病株用吸水纸包好，整株带回实验室，保存于4冰箱，备用。3 样品处理截取适量待检测样品，悬浮于装有适量无菌水的试管中并剪碎，静置30 min；或加适量无菌水研磨，静置5 min，取上清液。以悬浮液或上清液为模板，以无菌水为空白对照，进行LAMP检测。4 LAMP反应以提取的疑似作物病株样品组织悬浮液或上清液为模板，以模式菌株GMI1000菌悬液为阳性模板，以无菌水为阴性模板，采用特异性引物（附件

5、A）对待测样品进行LAMP检测。扩增反应在25 L体系中进行，各组分如下：2.5 L 10Thermo Pol buffer20mM Tris-HCl (PH8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100)，3.5 L 10 mM dNTP，1.5 L 100 mM MgSO4，5 L 5LAMP引物混合物（附件A），1 L样本悬浮液或上清液，1 L Bst 2.0 DNA聚合酶（8000 U/mL）, 4 L 5 M 甜菜碱, 1 L 12.5 mM Mncl2， 1 L 0.6 M钙黄绿素，去离子水补足至25

6、L。LAMP反应条件为: 60反应60 min，80 5 min使酶热变性失活终止反应。5 LAMP检测结果判断LAMP反应结束后，通过观察反应液颜色的变化进行判断。阳性结果颜色为绿色，阴性结果颜色为桔红色。或对LAMP产物进行电泳分析。取3 L反应产物，加入0.5 L 6倍上样缓冲液（6loading buffer）,混匀，在2%的琼脂糖凝胶上90 V恒压电泳30 min, 凝胶成像仪扫描拍照进行判断。阳性结果产生梯形条带，阴性结果无条带。AA附录A （资料性附录）LAMP检测引物、5LAMP混合引物配制及反应体系和条件A.1 LAMP检测引物引物名称引物序列长度/bp F35- CAACA

7、CCGGCGATGACTG -318B35- GATCGGTCGCATAGAACGC -319FIP5- GGATCACGTGGTCCTGCGCCGCCATCAAGTCCGGCAAGA -340BIP5- ACGCTCGGCAGCGAGATGTGCGCATCGTCAGGTTG -336A.2 5LAMP引物混合液1mL 5LAMP混合引物配制：引物名称母液浓度加入量混合液中终浓度FIP引物100 m80 L8 mBIP引物100 m80 L8 mF3引物100 m10 L1 mB3引物100 m10 L1 mddH2O820 Ltotal1 mlA.3 LAMP反应体系25 L LAMP反应体系：试剂名称用量10Thermo Pol buffer2.5 LdNTP（10 mM）3.5 LMgSO4（100 mM）1.5 L5LAMP引物混合物5 L样本悬浮液或上清液1 LBst DNA聚合酶（8000 U/mL