生化实验基本操作

1、.,实验一 生化实验基本操作,临床生物化学与分子生物学教研室,.,生物化学基本技术及应用,一、实验常识 （一）、实验室规则及安全及防护知识 1自觉地遵守课堂纪律，维护课堂秩序，保持室内安静。必须穿白大褂，不能穿背心、拖鞋进入实验室。,.,2要认真、严肃、积极、主动地做实验，要听从教师的指导。实验过程中要认真做好观察、记录。完成实验后经教师检查同意，方可离开。实验完成后要及时的按要求完成实验报告。,.,3注意保持实验室的整洁。实验完毕，须将药品试剂排列整齐，仪器要放好，将实验台面抹拭干净。使用后的玻璃仪器要清洗干净放好。,.,4要爱护实验仪器，节约使用各种试剂、物品。使用仪器时，应小心仔细，防止

2、损坏仪器。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障立即报告教师，不要自己动手检修。仪器损坏时，应如实向教师报告。,.,5废弃液体(强酸强碱溶液必须先用水稀释)可倒入水槽内，同时放水冲走。废纸及其他固体废物和带有渣滓沉淀的废液都应倒入指定的垃圾筐内，不得倒入水槽或到处乱扔。,.,6对实验的内容和安排不合理的地方可提出改进意见。对实验中出现的一切反常现象应进行讨论，并大胆提出自己的看法，做到生动、活泼、主动地学习。,.,7使用电器设备(如恒温水浴、离心机、电炉等)时，严防触电；绝不可用湿手或在眼睛旁视时开关电闸和电器开关。检查电器设备是否漏电应用试电笔或手背触及仪器表面。凡是漏电的仪器一律

3、不能使用。,.,8可燃物，特别是易燃物(如乙醚、丙酮、乙醇、苯等)时，应特别小心。不要大量放在桌上，更不应放在近火焰处。低沸点的有机溶剂不准在火焰上直接加热，只能在水浴上利用回流冷凝管加热或蒸馏。,.,9使用浓酸、浓碱，必须极为小心地操作，防止溅失。用吸量管取这些试剂时，必须使用橡皮球，绝对不能用口吸。若不慎溅在实验台或地面，必须及时用湿抹布擦洗干净。如果触及皮肤，应立即治疗。,.,10如果不慎倾出了相当量的易燃液体，则应按下法处理：(1)立即关闭室内所有的火源和电加热器。(2)关门，开启小窗及窗户。(3)用毛巾或抹布擦拭洒出的液体，并将液体拧到大的容器中，然后再倒入带塞的玻璃瓶。,.,11实

4、验中一旦发生火灾切不可惊慌失措，应保持镇静。首先立即切断室内一切火源和电源。然后根据具体情况积极正确地进行抢救和灭火。,.,（二）、实验记录及实验报告,1实验记录 实验中观察到的现象、结果和数据，应及时地直接记在记录本上。原始记录必须准确、简练、详尽、清楚。记录时，应做到如实正确记录实验结果，不可夹杂主观因素。在定量实验中观测的数据，如称量物的质量、滴定管的读数、光度计的读数等，都应设计表格准确记下读数，并根据仪器的精确度准确记录有效数字。,.,实验中使用仪器的类型、编号及试剂的规格、化学式、分子量、准确的浓度等，也应如实记录，以便在总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据。,.,如果发

5、现记录的结果有可疑、遗漏、丢失等，都必须重做实验。因为，将不可靠的结果当做正确的记录，在实际工作中可能造成难以估计的损失。所以，在学习期间就应一丝不苟，努力培养严谨的科学作风。,.,2实验报告,实验结束后，应及时整理和总结实验结果，写出实验报告。下面列举实验报告的书写格式，仅供参考。,.,实验报告书写要求：实验名称、实验日期、目的和要求、原理、实验测定的数据、图纸及结果、结果分析和讨论。,.,原理：实验原理简要归纳，一些可用化学反应式表示。 数据、图纸及结果：将一定实验条件下获得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如原始数据及其处理的表格、标准曲线图以及实验组与对

6、照组实验结果的比较图表等。,.,结果分析和讨论：讨论部分不是对实验结果的重述，而是关于实验方法(或操作技术)和有关实验的一些问题，如对实验的正常结果和异常现象以及思考题进行探讨；对于实验设计的认识、体会和建议；对实验课的改进意见等。,.,1新购置玻璃仪器的清洗 新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用肥皂水(或去污粉)洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在l2盐酸溶液中过夜(不少于4h)，再用自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗23次，在烘箱内 。,.,2使用过的玻璃仪器的清洗 (1)一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等、，先用自来水冲洗至无污物，再选用大小合适的毛刷沾取去洗衣粉或肥皂水，将器皿内

7、外(特别是内壁)细心刷洗，再用自来水冲洗干净，洗至容器内壁光洁不挂水珠为止，最后用蒸馏水冲洗23次，倒置在清洁处晾干，急用时可用干燥箱烤干。,.,(2)容量仪器：如吸量管、滴定管、量瓶等，使用后应立即浸泡于凉水中，勿使物质干涸。工作完毕后用流水冲洗，以除去附着的试剂、蛋白质等物质，晾干后浸泡在铬酸洗液中46 h(或过夜)，再用自来水反复冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗23次，晾干备用。,.,(3)其他：盛装具有传染性样品的容器，如病毒、传染病患者的血清等沾污过的容器，应先进行高压(或其他方法)消毒后再进行清洗。盛过各种毒品，特别是剧毒药品和放射性同位素物质的容器，必须经过专门处理(略)，确知没有残余

8、毒物存在方可进行清洗。,.,四、实验室基本操作和常识,（一）玻璃仪器的清洗 玻璃仪器是生物化学中不可缺少的器具。实验中所使用的玻璃仪器清洁与否，直接影响实验结果，往往由于仪器的不清洁或被污染而造成较大的实验误差，甚至会出现相反的实验结果。因此，玻璃仪器的洗涤清洁工作是非常重要的。,.,（二）吸量管的使用,吸量管（简称吸管）是生化实验中最常用的仪器，可分为三类：奥氏吸管，移液管，刻度吸管。,.,刻度吸管的使用： （1）选择：使用前先根据需要选择适当的吸量管，刻度吸管的总量最好等于或稍大于最大取液量。临用前要看清容量和刻度。,.,（2）执管：用右手拇指和中指（辅以无名指），拿住吸管的上部，用食指堵

9、住管上口和控制液流，刻度数字要对向自己。切忌用大拇指堵住管口，控制流量。,.,（3）取液：另一左手捏压吸耳球，将吸管插入所量取的试剂溶液中，用吸耳球下端出口对准吸管的上口，将液体轻轻吸上至所需取量刻度上端稍高处，立即用右手食指堵住管口。,.,（4）调准刻度：将吸管从溶液中取出，吸管轻轻刮于试剂瓶口，如液体粘性大，可用滤纸擦干管尖外壁，然后用食指控制流量，使液体缓慢下降至所需刻度（注意液体凹面与视线和刻度应在同一平面，此时立即压紧吸管上口，使液体不再流出）。,.,（5）放液：放松食指，让液体自然流入试管内，管尖不要插入试管下部原有的溶液中，以免污染吸管和试剂，当液体流出完后，让吸管尖端停靠容器内

10、壁3-5秒钟。刻度吸量管未注明吹的不能吹出残液。,.,（6）洗涤：用过的吸管要另放好，不能跟干净的吸管同放，混淆不清，待做完实验后要清洗。,.,(三)溶液的混匀,样品与试剂的混匀是保证化学反应充分进行地一种有效措施。为使反应体系内各物质迅速地相互接触，必须借助于外加的机械作用。混匀时须防止容器内液体溅出或被污染。严禁用手指直接堵塞试管口或锥形瓶口振摇。混匀的手法有以下几种，可随使用的器皿和液体容量而选择。,.,1玻棒搅动法 适用于烧杯内容物的混匀，如固体试剂的溶解和混匀。 2吸量管混匀法 用吸管将溶液反复吸放数次，使溶液充分混匀。,.,3倒转混匀法 适用于有塞量筒和容量瓶、试管内容物的混匀。一

11、般试管内容物的混匀可用聚乙烯等薄膜封口，再用手按住管口倒转混匀。,.,4指弹混匀法 左手持试管上端多用右手指轻轻弹动试管下部，使管内溶液作旋涡运动。 5旋转混匀法 用手持容器，使溶液作离心旋转，适用于未盛满液体的试管或小口器皿，如锥形瓶。旋转试管时最好用手腕旋转。,.,6甩动棍匀法 右手持试管上部轻轻甩动振摇，即可混匀。 7电磁搅拌混匀法 在电磁搅拌机上放置烧杯梦在烧杯内放入封闭于玻璃或塑料管中的小铁棒，利用磁力使小铁棒旋转以达到混匀杯中液体的目的。适用于酸碱自动滴定，pH梯度滴定等。,.,8振荡器混匀法 利用振荡器使容器中的内容物振荡，达到混匀的目的。,.,二、基本技术及应用,（一）分 光

12、光 度 法 技 术,.,物质对光线有选择性的吸收作用。不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同。因此，每种物质都具有其特异吸收光谱。根据物质的吸收光谱进行定性或定量分析的方法称为吸收光谱法，或分光光度法。该法所用的仪器称为分光光度计或吸收光谱仪。,.,分光光度法具有操作简便，快速等特点，它是生物化学分析的重要手段之一，也是其他学科进行分析研究的重要手段之一，对医学生来说是一项重要的操作技术。,.,原理 分光光度法作为定量分析的基本依据是Lambert-Beer定律，他们根据一系列的实验证明：当一束单色光通过溶液介质时，部分光能被溶液吸收。吸收的比值（透射光/入射光）和入射光的

13、强度无关，但与介质的厚度及介质的浓度成正比。,.,A=KCL 当溶液厚度(L)不变时，对于不同浓度的同一物质和同样波长的单色光（即消光系数不变)，溶液的吸光度和溶液的浓度成正比： A1/A2=C1/C2 C1=A1C2/A2,.,式中C2为标准液的浓度，可根据测得的吸光度值，按公式（3）求得待测溶液的浓度(C1)。 实际工作中为简便起见，常常事先测定一系列不同浓度的标准管，然后以吸光度对标准浓度作图，得到标准曲线，测得待测物质的吸光度后，可(从)标准曲线上查出。,.,可见光分光光度计,.,722型分光光度计的使用： 1接通电源预热20分钟(此时暗箱盖应打开)。 2转动波长选择扭，选用所需的波长

14、。 3固定灵敏度。(一般使用“灵敏度调节旋钮”1档，如调不到“T=100”再选用较高档，中途不再变动),.,4调节“0”点。揭开比色杯暗箱盖（光门自动关闭），转动“0%T旋钮”，使数字显示为0.00处。 5放置比色杯 将盛有溶液的比色杯放置于比色杯架中。,.,6调节T=100。将比色杯放入比色杯架，使空白管对向光路，盖好比色杯暗箱盖，转动“100%T旋钮”。调准电表指针指向T=100处。 7测定，读数。拉动比色杯座的拉杆，使测定杯进入光路，迅速从电表上读出吸光度值，记录。测定过程中随时拉回拉杆到原位，是空白进入光路，观察指针是否在T=100处，如不在及时调节。,.,8关机。关上电源开关；取出比

15、色杯，检查比色杯架是否弄湿、弄脏，如比色杯架脏或湿，应取出冲洗干净，擦干后放回原处，然后将暗箱盖好，清洗比色杯并凉干。,.,注意事项：,1为了防止光电管疲劳，不测定时必须将比色槽暗箱盖打开，使光路切断，以延长电管使用寿命。 2拿比色杯时，手指只能捏住毛玻璃面、不能碰比色杯的透光面，以免沾污。装溶液时，液量为比色杯容积的3/4为宜。,.,3比色杯外壁的液体用擦镜纸或细而软的吸水纸吸干，再放入比色槽。不能用吸水纸擦比色杯内壁。 4测定有色溶液时，一定要用少量的原液（有色溶液）洗比色杯内壁12次，以免改变有色溶液的浓度。另外，在测一系列溶液时，通常是按从稀到浓的顺序测定，以减少测量误差。,.,5本型

16、仪器A值在0.20.7之间误差较小，准确度较高。所以在测定时，可根据溶液的浓度选用不同厚度的比色杯）但同一实验中应用同规格比色杯，中途不能更换)，使溶液的吸光度控制在0.20.7之间,.,6用完比色杯应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净。不能用碱性溶液或氧化性很强的洗涤剂，以免损坏，也不能用毛刷洗，以免损伤透光面。,.,离 心 技 术,基本原理 离心技术是利用微粒绕轴旋转时借惯性的离心运动，产生的强大离心力，将混合物中密度不同的各组分分离的方法。,.,离心力场的大小常用重力来表示，称为相对离心力（RCF）。一般情况下，在低速或高速离心时常用转速n即每分钟的转数（rmin）来表示；超速离心时常用重

17、力加速度g的倍数来表示。,.,离心机分类 （1）按离心管在离心时所处的位置不同，可分为斜角式离心机和水平式离心机 （2）按最大转速不同，可分为普通（低速）离心机、高速离心机和超速离心机。一般将转速在4000r/ min以下的离心机归于普通离心机，转速在600025000r/min的离心机归于高速速离心机；转速在25000r / min以上的离心机归于超速离心机。,.,（3）按用途不同，可分为制备用离心机、分析用离心机。 （4）按操作温度不同，可分为无冷冻离心机和冷冻离心机，后者附带有制冷设备，适于在较高温度时易分解或酶解的生物大分子的分离。 实验室中最常用的是普通离心机,.,普通离心机使用要点,1离心机为高速旋转设备，放置必须绝对平稳，否则会产生强烈震动甚至移位。 2