基因工程的基本技术 精选文档

1、第二章,基因工程操作的基本技术,主要内容,?,PCR,技术,?,DNA,重组技术,基因工,程技术,?,重,组,子,克,隆,基因工程的基本技术,之一,第一节,一、核酸提取技术,?,核酸,包括脱氧核糖核酸（,DNA,）和核糖,核酸（,RNA,）,;,?,脱氧核糖核酸（,DNA,）包括,线状,基因组,DNA,和,环状,DNA,（质粒,DNA,）。,1,、植物组织中基因组,DNA,的提取,思考：,DNA,如何从细胞中取出？,植物组织中基因组,DNA,的提取原理,：,用,机械研磨,使组织和细胞破碎，然后加,入,SDS,、,CTAB,等,离子型表面活性剂,，使细,胞膜和核膜破裂，解聚核中的核蛋白（并与,蛋

2、白质形成混合物），然后在酚和氯仿等表,面活性剂的作用下使,蛋白变性,，再经离心除,去组织和变性蛋白，上清夜加乙醇使,DNA,沉,淀,。,再思考：,1,、研磨破碎组织必,须在,低温,下进行。,-,为什么？,2,、幼嫩组织,DNA,的得率高还是低？,防止,DNA,降解,。,得率高！,提取,DNA,的质量鉴定：,DNA,的相对完整性：凝胶电泳,DNA,的纯度：测,OD,值,吸收峰：,DNA,紫外光,260nm,蛋白质,紫外光,280nm,比值：,OD260/280 = 1.8-2.0,较纯,OD260/280 1.8-2.0,杂质多,2,、质粒,DNA,的提取,基因组,DNA,质粒,DNA,?,质粒

3、具有自主复制,和转录能力，能在子,代细胞中保持恒定的,拷贝数，并表达所携,带的遗传信息。,?,质粒,(Plasmid),是一种染色体外的稳定遗传,因子，大小从,1-200kb,不等，为双链、闭环,的,DNA,分子，并以超螺旋状态存在于宿主细,胞中。,质粒,DNA,提取方法：,碱裂解法,、煮沸法、,SDS,法等,碱裂解法,原理：,在,碱性,条件,下，双连,DNA,氢键断裂，,结构破坏变性，环状超螺旋质粒,不充分,变性,。在中性条件下变性质粒恢复原来,构型，而线性大分子细菌,DNA,不能复性呈,不溶物而经离心除去。,抽提质粒,DNA,所需的溶液：,、,溶液,：,50 mol/L,葡萄糖，,25 m

4、mol/L Tris-Cl,（,pH8.0,），,10 mmol/L EDTA (pH8.0),；,、,溶液,：,0.2 mol/L NaOH,，,1%SDS(w/v),，,现配现用；,、,溶液,：,3 mol/L KAc,，用冰醋酸调,pH,值至,5.2,；,实验步骤,1,、接种、摇菌；,2,、把菌液放入,Ep,管中，离心，弃上清；,3,、加入,200L,预冷的含,Rnase,的溶液,I,，涡旋,混匀；,4,、加入,200L,的溶液,，温和混匀，室温静,置,5min,；,5,、加入,200L,的溶液,，温和混匀，冰浴,15min,；,6,、离心，吸上清至另一,EP,管；,7,、加等量的氯仿,

5、/,异戊醇（,V,：,V=24,：,1,）抽,提，离心,；,8,、移取上清液，加入,2,倍体积无水乙醇，混,匀，,-20,静置,5min,，离心，弃上清；,9,、用,70%,乙醇洗,DNA,沉淀,2,次，离心，倒掉,乙醇，吹干；,10,、用,TE,（,pH8.0,，）溶解质粒,DNA,，并加,入,RnaseA,达浓度为,10g/ml,，,37,放置,1,小,时,11,、取,1L,质粒,DNA,用于电泳检测。, 抽提出质粒的构型：,1,）,超螺旋,质粒,DNA,:,在提取质粒过程中，,超螺旋,DNA,占大部分。,2,）,开环,质粒,DNA,：如果质粒,DNA,两条链中,有一条链发生一处或多处断裂

6、，分子就能,旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状,分子，称开环,DNA,。,3,）,线状,质粒,DNA,：如果质粒,DNA,的两条链在,同一处断裂，则形成线状,DNA,。,抽提出的质粒三种构型,电泳结果,：,1,）,开,环,2,）,线,状,3,）,超螺旋,+,-,电,泳,方,向,DNA,的浓缩与纯化（,P31-33,）,?,DNA,的浓缩：,乙醇沉淀法,正丁醇抽提法,聚已二醇浓缩法,?,DNA,的纯化：,氯化铯溴化已锭连续梯度离心法,离子交换层析法,琼脂糖凝胶电泳洗脱法,“基因纯”试剂纯化,二、凝胶电泳技术,电泳目的：对核酸分子进行分离和检测,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,核酸分子分离的

7、原因：,在,碱性,环境下，核酸分子带,负电荷,，,在外加电场的作用下，分子在凝胶多孔性,刚性滤孔中从,负极向正极,泳动，其中主要,由于,分子筛效应,和,电荷效应,达到分离不同,大小核酸分子的目的。,电泳类型：,（一）、影响电泳迁移率的因素,1,、分子本身的影响,?,分子的大小：小则快,?,带电荷数：多则快,?,分子构型：超螺旋,解螺,旋,2,、电场：直流电场,?,电压高则快,?,电压太高则结果不准确,常用,35V/CM,?,操作简单；,?,分辨范围：,100bp-60kb,；,?,有效范围：,200bp-50kb,；,?,分辨率：,100bp,左右,3,、支持物介质,低熔点琼脂糖：用于,DNA

8、,的回收（,65,）,A,种类：,?,琼脂糖（,agarose,）凝胶：,?,常用于微卫星、测序分析；,?,分辨范围：,5-500bp,；,?,分辨率：,1bp,?,聚丙烯酰胺凝胶：,注意：,有神经毒性！,?,凝胶分辨,DNA,的能力：,琼脂糖,聚丙烯酰胺凝胶,浓度,分辨范围,(,kb,),浓度,分辨范围,(,bp,),0.3% 5-60 3.5 1000-2000,0.6% 1-20 5 90-500,0.7% 0.8-10,8.0 60-400,0.9% 0.5-7,12 40-200,1.2% 0.4-6,15 25-160,1.5% 0.2-3 20 6-100,B,凝胶浓度,:,?,

9、浓度,大,，筛孔小，适合,小,分子电泳；,?,浓度,小,，筛孔大，适合,大,分子电泳,凝胶浓度的选择：取决于待检测的,DNA,的大小,原来如,此！,4,、电泳缓冲液,?,pH,值：偏碱性，带负电荷,?,离子浓度：离子浓度高,?,电流大,?,发热快,?,胶溶解,?,种类：,TAE,（,Tris+EDTA+,醋酸）,:,电流大，易产生离子富集,TBE,（,Tris+ EDTA+,硼酸）,:,缓冲能力最强,TPE,（,Tris+ EDTA+,磷酸）,:,缓冲能力低,TNE,（,Tris+ EDTA+,醋酸钠）,电泳缓冲液的选择,?,TBE,缓冲力大于,TAE,；,?,高分子量的,DNA,选用,TAE

10、,，否则选用,TBE,；,?,基因组,DNA,酶切电泳选用,TAE,；,实验技巧：,?,问题：电泳缓冲液使用一定时间后由于,离子的富集,作用,，,DNA,在凝胶中出现跑不动现象。,解决办法：,一是更换成新配置的电泳缓冲液；,二是把电泳槽中倒出混匀后重新使用。,WHY,?,大家注意,了！,（二）、电泳指示剂和,DNA,染色剂,、,类型,：溴酚兰，二甲苯青,、作用：,(1),预知电泳的速率及方向；,(2),使样品呈现颜色，便于加样；,(3),与一些高浓度蔗糖或其它物质增加,DNA,的密度。,?,电泳,指示剂,?,DNA,染色剂,?,荧光染色剂,溴化已锭：,（,EB, Ethidium bromid

11、,）,吸收,300360nm UV,（紫外光）,放出,590nm,可见光（橙红色）,?,硝酸银：常用,0.1%,?,Goldview,染料,吸收紫外光，放出绿光（双链,DNA,）或橙红,色光（单链,DNA,）,（三）凝胶电泳过程,1,、制胶：称取一定量的琼脂糖用电泳缓冲液融解后倒,入制胶槽配制；,2,、放胶：胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液至没过胶,2,3mm,3,、点样：把,DNA,样品加入上样缓冲液混匀上样,4,、电泳：接通电源，调好电压,5,、看结果：紫外光观察。,?,1,、单向电泳,?,2,、脉冲电场电泳（,CHEF,）,?,3,、,反转,电场电泳（,FIGE,）,（四）、电泳种类,?,中

12、文名称：聚合酶链式反应,?,1,、,PCR,原理：,变性温度,下，,DNA,双链变性双螺旋解开成,单链,DNA,，在,退火温度,中人工合成的特异引物,根据碱基互补配对原则与单链,DNA,特异结合，,然后在,DNA,聚合酶的作用下，在,延伸温度下,不,同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物,的引导下,合成与模板,DNA,互补的新链,，实现,DNA,的扩增。,技术,3,：,PCR,技术,(polymerase chain reaction),?,2,、,PCR,反应过程：,变性：,DNA,双链变为单链；,退火：引物与模板结合；,延伸：合成互补链；,上述过程通过,PCR,仪的,程序设计及自动运作完

13、,成。,?,3,、,PCR,反应体系：,体系成分：,模板,DNA,、引物、,Taq,酶,(,热稳定,性,),、,dNTP,、反应缓冲液,（,Mg2+,、,BSA,、,Tween20,、,DTT,、,Tris.cl,）,。,1,）、引物（寡聚核苷酸）,一般成对出现，长度为,15-30,个核苷酸；,使用浓度：,0.1-0.5uM,，高达,1uM,；,引物设计原则：,1,、,G+C,含量,45-55%,；,2,、,Tm,值高于,55,；,3,、引物特异性；,4,、引物扩增跨度；,5,、是否形成引物二聚体,2,）、模板,DNA,：,基因组,DNA,、质粒,DNA,、其它,DNA,片段；,质量要求：不高

14、,3,）、,Taq,酶,(,热稳定性,),：,常规酶,高保真酶：,ExTaq,La Taq,酶,4,）、反应缓冲液成分：,BSA,、,Tween20,、,DTT,、明胶,-,保护酶作用,Tris.cl,提供缓冲作用,(2),、,dNTP,的浓度：,常用,100-200,mol/L,，不能低于,20,mol/L,，,特异性、保真性；,?,4,、影响,PCR,产量、质量的因素：,(1),、,Taq,酶：常用,1U/25,L,?,浓度低，扩增产物不够；,?,浓度高，非特异性扩增增加；,?,酶的活性；,(3),、,模板：主要考虑,纯度及使用量,对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则,难以成功。使用量从

15、几个,ng,到,100ng.,(4),、,引物浓度：,0.1-0.5,mol/L,之间，过多则非特异扩增增,加，形成,引物二聚体,；,(5),、,Mg,2+,浓度：,常用,0.5-2.5,m,mol/L,；,影响：酶的活性、引物,-,模板退火、特异性,(6),、,PCR,反应程序设定：,(1),、变性温度和时间,：,要求变性彻底，但要考虑酶的半衰期：92.5,（,2,小时）95 （,40min,）97 （,5min,）94变性,比较彻底，酶的半衰期也不短。,(2),、引物退火温度,Tm,与时间；,Tm,值由引物,ATGC,数决定每,A,、,T,计为2，,G,、,C,计为4，时间一般为,40,秒

16、到,60,秒,(3),、,引物延伸温度与时间,：,72最佳，,30-100nt/s,，也有用68 如,La Taq,(4),、循环数：,25-35 cycles,之间，过多则非特异扩增增,加；平台效应；,以普通,PCR 50,?,l reaction solution,为例,),10,?,PCR buffer,25mM MgCl,2,dNTP Mixture (10mM each),primer 1,（,10,?,M),primer 2 (10,?,M),Taq polymerase (5U/,?,l),DNA template (0.1,?,g/,?,l),ddH,2,O,total,5,?

17、,l (1,?,),4,?,l (2mM),1,?,l(0.1mM),1,?,l(0.2,?,M),1,?,l(0.2,?,M),0.6,?,l(2U/50,?,l),1,?,l,36.5,?,l,50,?,l,5,、,PCR,例子（,Example of reaction solution,）,反应体系配置：,PCR thermal program,94,?,C,94,?,C,Tm,72,?,C,72,?,C,4,?,C,1min,30sec,30sec,1min,5,?,C,endless,30 cycles,循环数,Heat denaturation,Heat denature,Prim

18、ers annealing,Extension,Last extension,Ending reaction,设计的反应程序,相应作用,6,、,PCR,的种类,?,RT-PCR,?,特异,PCR,?,锚定,PCR,?,反向,PCR,?,套式,PCR,?,不对称,PCR,?,长程,PCR,?,锅柄,PCR,?,免疫,PCR,?,RAPD,?,定量,PCR,?,原位,PCR,F,R,?,（,1,）特异,PCR,扩增所用的引物是特异的，扩出的产物也是特,定的。,?,（,2,）,RT-PCR,：,是一类以,mRNA,为最初模板的基因的扩增。,A A A A A A A A A A,5CAP,T T T

19、 T T T T T T T T,?,（,3,）反向,PCR,：,根据已知序列扩增两侧序列的方法。,已知序列,未知序列,未知序列,酶切,酶切,引物,2,引物,1,此,PCR,操作过程：,酶切基因组,DNA,连接环化目的,DNA,用引物,1,和引物,2,组合扩增出侧翼序列,?,（,4,）定量,PCR,用途：,分析,基因组中某,个基因的拷,贝数或分析,基因的转录,表达丰度。,实时荧光定量,PCR,技术，是指在,PCR,反,应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累,实时监测整个,PCR,进程，最后通过标准曲线,对未知模板进行定量分析的方法。,概念：,原理：通过,实时检测,PCR,每一个循环扩增产物相对,应的荧光信号，,来实现对,起始模板,进行定量及定性,的分析。,初始模板量,X0,的对数值与,C(T),值之间呈线性关系：,log,X0,= - log(1+Ex) *,Ct,+ log N,Threshold line,C(t) value,C(t) value,18.12 +/,-,0.04,阈值线,Ct,值,Ct,值,Ct,值的定义,在荧光定量,PCR,技术中，有一个很重要的概念,Ct,值。,C,代表,Cycle,，,t,代表,threshold,Ct,值的含义是：,每个反应管内的荧光信号开始由,本底,进入指数增长阶段时,到达设定的域值时所经历的循环,数（如后图所示）,PCR,