第四章、第二讲

1、第四章、第二讲,4.3,发酵工业的无菌技术,4.4,发酵培养基及设备管道,灭菌,4.3,发酵工业的无菌技术,?,?,?,?,干热灭菌法,湿热灭菌法,射线灭菌法,化学药剂灭菌,法,?,过滤除菌法,?,火焰灭菌法,4.4,发酵培养基及设备管道灭菌,培养基灭菌的有关理论,湿,热灭菌原理,（一）加热灭菌原理,1,、微生物的热阻,?,每一种微生物都有一定的生长温度范围；,?,当微生物处在最低生长温度以下，代谢作用几乎停止，而,处于休眠状态；当温度超过最高限度时，细胞中原生质体和,酶的基本成分就发生不可逆的变性，使微生物死亡。,不同种类微生物对热的抵抗力不同。,微生物对热的抵抗力称为,热阻,（,heat

2、resistance,）,。,某些微生物对湿热的相对热阻,（与大肠杆菌比较）,微生物,相对热阻,大肠杆菌,1,6,细菌芽孢,3,10,霉菌孢子,2-10,病毒及噬菌体,1-5,下面介绍与热阻相关的几个概念,1,）致死温度（,Death temperature,）,杀死微生物的极限温度称为致死温度。,2,）热力致死时间,(Thermal Death Time; TDT),在特定条件、特定温度下，杀死某种微生物,所需的最短时间。,e.g,伤寒杆菌,58,30min,变形杆菌,55,60min,2,、微生物的热死规律,对数残留定律,微生物的热死是指微生物的受热失活，但物理性质不变。,微生物虽然是一复

3、杂的高分子体系，但受热死亡是由于,蛋白质变性所致。,在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论。,对数残留定律的概念：,对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死,亡的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定,律。,数学表达式：,- dN/d,?,=,?,N,N,培养基中活的微生物个数；,?,时间（,s,）,;,?,比死亡速率（,s,-1,）,(,死亡速率常数,),dN/d,?,微生物的瞬间变化率，即死亡速率,若开始灭菌（,?,= 0,）时，培养基中活的微生物数为,N,0,- dN/d,?,=,?,N,积分,lnN/N,0,= -,?,or,2.303logN,0,/N =,?,?

4、,= 2.303 logN,0,/N /,?,?,= 2.303 lgN,0,/N /,?,可见灭菌时间取决于污染程度,(N,0,),、灭菌程度,（残留菌数,N,）和,?,值,在培养基中有各种各样的微生物，不可能逐一加以考虑。,一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据,。,灭菌程度，即残留菌数，如果要求完全彻底灭菌，即,N =,0,，则,?,为，上式无意义，事实上也不可能。,一般取,N = 0.001,，即,1000,次灭菌中有,1,次失败。,例：,有一发酵罐内装,40m,3,培养基，在121温度下进行实罐灭,菌。原污染程度为每,ml,有,2,10,5,个耐热细菌芽孢，,121时灭,菌

5、速度常数为,1.8min,1,。求灭菌失败几率为,0.001,时所需的灭,菌时间。,解：,N,0,= 40,10,6,2,10,5,= 8,10,12,(,个,),N = 0.001;,?,= 1.8 (min,1,),?,=,2.303,?,lg,N,0,N,=,2.303,1.8,15,),(8,10,lg,= 20.34 (min),3,、死亡速率常数,?,（比死亡速率）,死亡速率,常数,?,是微生物耐热性的一种特征，它随,微生物种类和灭菌温度而异。,相同温度下，,?,值越小，则此微生物越耐热。,在,121,，细菌芽孢的,?,值约为,1min,-1,而营养细胞的,?,值,为,10-10,

6、10,min,-1,。,121某些细菌芽孢的,?,值,细菌芽孢名称,枯草芽孢杆菌,FS5230,硬脂嗜热芽孢杆菌,FS1518,硬脂嗜热芽孢杆菌,FS617,产气梭状芽孢杆菌,PA3679,?,值,min,-1,3.8-2.6,0.77,2.9,1.8,4,、培养基灭菌温度的选择,培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基,成分被破坏，在加热下氨基酸、维生素等受破坏。,培养基灭菌时，必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养,基成分破坏减至最少的条件。,灭菌过程微生物死亡属于一级反应动力学类型（从对数残,留定律表达式可知）。,在其它条件不变时，比死亡速率,?,与温度的关系可用阿仑尼,乌斯方程

7、式表示。,Svante August Arrhenius,was a Swedish physical chemist best known,for his theory that electrolytes, certain,substances that dissolve in water to yield a,solution that conducts electricity, are,separated, or dissociated, into electrically,charged particles, or ions, even when there is,no current

8、 flowing through the solution. In,1903 he was awarded the Nobel Prize for,Chemistry.,?,= A e,A,比例常数；,E,R T,Arrhenius equation,E,杀死细菌所需的活化能，,(,?,E),（,4.18 J/mol,）,;,T,绝对温度，,(K),R,气体常数，,1.978,4.18 J/(molK),e,2.71 (exp),?,= A e,E,R T,E,lg,?,=,+ lgA,2.303RT,以,lg,?,对,1/T,作图，得一直线，其斜率为,-E/2.303R,，截距为,lgA,，

9、,从斜率和截距科求得,A,和,E,值。,l,g,?,斜率,=,E/2.303R,截距,= lgA,1/T,培养基成分受热破坏是化学分解反应，为一级动力学反应：,- dC / d,?,=,?,C,C,对热不稳定物质的浓度, (mol/L);,?,分解速率常数,（,s,1,）；,?,分解反应时间,（,s,）,?,随反应物质种类和温度不同,在化学反应中，其他条件不变，,?,和温度的关系也可用阿,仑尼乌斯方程表示：,?,= A e,A,比例常数；,E,R T,E ,分解活化能，,(,?,E) （,4.18 J/mol,）,;,T,绝对温度，,(K),R,气体常数，,1.978,4.18 J/(molK

10、),e,2.71 (exp),在灭菌时，当温度变化，菌死亡速率常数,?,和培养基成分破坏速率常数,?,都变化。,温度由,T,1,升高到,T,2,，,?,值分别为：,E,R T,1,E,R T,2,?,1,= A e,相除取对数,?,2,= A e,?,2,ln,=,?,1,R T,1,T,2,E 1 1,同样，灭菌时培养基成分的破坏也可得类似关系：,ln,?,2,?,1,=,R T,T,1,2,E,1 1,上面两式相除，得,名称,E (J/mol),70.3,87.9,96.7,92.1,283,318,343,ln(,?,2,/,?,1,),ln(,?,2,/,?,1,),泛酸,E,维生素,

11、B12,维生素,B1,由于灭菌的,E,大于培养基成分分解的E,嗜热脂肪芽孢杆菌,枯草杆菌,因此,肉毒梭菌,E,叶酸,ln,?,2,/,?,1,ln,?,2,/,?,1,即随着温度的上升，灭菌的速度常数的增加倍数大于培养,基成分破坏的增加倍数。或者说，当灭菌温度上升时，微生,物杀灭速度的上升超过培养基成分破坏的速度。,根据这一理论，培养基灭菌采用高温短时间的,方法，有利于减少营养成分的破坏。,灭菌温度/ 灭菌时间,/min,维生素,B1,破坏量,/%,100 400 99.3,110 36 67,115 15 50,120 4 27,130 0.5 8,145 0.08 2,150 0.01,1

12、,（二）影响培养基灭菌的主要因素,1,、微生物热阻,（前述）,影响培养基灭菌的主要因素（,continued,）,2,、,pH,微生物在,pH6.0,8.0,范围内耐热性最大,pH,低于,6.0,时，氢离子极易渗入微生物细胞，从而改,变细胞的生理反应而促进其死亡，故培养基酸度愈高，,则所需的杀菌时间愈短。,影响培养基灭菌的主要因素（,continued,）,pH,对灭菌时间的影响,温度,孢子数,灭菌时间,(min),() (个,/ml)pH=6.1 5.3 5.0 4.7 4.5,120 10000,8 7 5 3 3,115 10000,25 25 16 13 13,110 10000,70

13、 65 35 30 24,100 10000,740 720 180 150 150,影响培养基灭菌的主要因素（,continued,）,3,、菌的浓度,浓度越高，所需灭菌时间越长,例如：,如肉毒梭状芽孢杆菌，在105湿热灭菌时间,芽孢杆菌数,/ml,时间,(min),9,10,8,48 9,10,6,36 9,10,4,20,9,10,2,14 9,2,影响培养基灭菌的主要因素（,continued,）,4,、,培养基成分,油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性,因高浓度有机物会环绕细菌的四周形成一层薄膜，影响热的,传入。,而高浓度的盐类、色素等则削弱其抗性,影响培养基灭菌的主要因

14、素（,continued,）,5,、泡沫,泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去杀死其,中潜伏的微生物；,易产生泡沫的培养基在灭菌时，可加入少量消泡剂。,6,、颗粒,颗粒小，灭菌容易，颗粒大，灭菌难。,三、分批灭菌,（一）操作,（实罐灭菌）,1,、,在进行培养基灭菌之前，通常应先把发酵罐的,分空气过滤器灭菌并用无菌空气吹干。,若已先行空罐灭菌，此步可不进行,2,、,预热,向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培养基加热至70左右。,作用：,利于糊化；减少冷凝水的生成；减轻噪音,有的工厂省却此步；需通过试验掌握冷凝水的生成量，,确保培养基的浓度。,升,温,阶,段,3,、开启蒸汽管，向培养基中通入蒸汽

15、，升温。,4,、罐压达,1kg/cm,2,( 0.1 MPa),时，按装在发酵罐封,头的接种管、补料管、消泡剂管等应排汽。,保,温,阶,段,5,、保温,调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度,保持在一稳定水平，维持一定时间。,在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道都,应通入蒸汽；在液面上的其余管道则应排放蒸汽，,这样才能保证灭菌彻底，不留死角。,降,温,阶,段,6,、保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀；待罐内,压力降至,0.5kg/cm,2,左右时，向罐内通入无菌空气，,向夹套或蛇管中通入冷水，使培养基降至所需温度。,通入无菌空气的作用：加速降温；保持罐内正压,（二）,灭菌时间的计算,小型罐升

16、降温,快，可忽略；,但大型罐不可,忽视,B,C,A,升温,保温,降温,D,min,V = V,加热,+ V,维持,+ V,冷却,RT,2,(E,2RT),V,加热,=,t,加热,(T-T,0,)E,2,RT,2,(E,2RT),V,冷却,=,t,冷却,(T-T,0,)E,2,R,：气体常数；,= 1. 986 ,卡,/,克分子K,E,：耐热孢子致死的活化能；,= 65000 ,卡,/,克分子,T,：灭菌维持温度；,121 （,393 K,）,T,0,：开始计算灭菌效果的温度；100 （,373 K,）,例：,1,）小型发酵罐在120灭菌维持,15,分钟，由100 （100以,下灭菌效果不计）加

17、热至120的时间为,5,分钟，由120冷却,到100的时间为,3,分钟，计算总的灭菌时间。,1.986,393,2,(65000,2,1.986,393),V,加热,=,5 = 1.15,(393-373),65000,2,1.986,393,2,(65000,2,1.986,393),V,冷却,=,5 = 0. 69,(393-373),65000,2,V = V,加热,+ V,维持,+ V,冷却,= 1.15 + 15 + 0.69 = 16.6 (min),例,）,如果灭菌条件不变，大罐由,加热到,需分钟；冷却至,的时间为分钟；求大罐,的维持时间,。,1.986,393,2,(65000

18、,1.986,393),V,加热,V,冷却,=,（,）,(393-373),65000,2,.,min,则大罐维持时间,V,维持,= V,（,V,加热,V,冷却）,16.6,9.2 = 7.4 min,在不同规模的发酵罐中达到同样灭菌效果所需时间,发酵罐规模（升）,维持时间（分）,200 17. 5,500 12. 6,5000 11. 3,50000 8. 8,（三）,分批灭菌的优缺点,优点：,不需专门的灭菌设备，投资少、设备简单、灭菌效果可靠。,对蒸汽的要求较低，一般,3-4kg/cm,2,即可满足。,缺点：,在灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大,中小型罐经常采用,四、培养基的连

19、续灭菌,（连消）,将配制好的培养基在向发酵罐输送的同时加热、,保温和冷却，进行灭菌。,灭菌时间与温度的关系（以杀死细菌芽孢为准）,温度,（）,时间,（,min),121 24.8,130 4.1,138 0.72,146 0.14,154 0.029,163 0.0061,（一）连续灭菌流程,1,配料罐,3,连消装置,4,维持罐,6,冷却装置,配料罐（兼作预热）,连续灭菌流程,输料泵,连消塔（器）,维持罐（管）,冷却器,发酵罐,1,、预热,可在专门的预热罐，也可用配料罐兼作,温度：,一般预热至70左右,预热的物料用泵泵入连消装置,输料泵：,常用,旋涡泵、往复泵、螺杆泵,旋涡泵,往复泵,螺杆泵,

20、2,、加热,物料泵入加热器，培养基与蒸汽混合，温度迅速上升,至,130,140,常用连消装置有三类：,套管式连消器,汽液混合式连消器,喷射式加热器,套管式连消塔,上疏下密，,45,小孔，孔,径,6,毫米左右,培养液流动线速度小于,0.1m/s ;,在管内逗留时间,为,15,20,秒,汽液混合式连消器,喷射加热器,1,喷嘴,2,吸入口,3,吸入室,4,混合喷嘴,5,混合段,6,扩大管,3,、保温,保温设备,（维持设备）,保温材料包裹,两种形式：,罐式；管式,1,、维持罐,连续灭菌时，关,2,开,1,；,预热罐中的物料输送完后，,关,1,开,2,。,培养基的平均停留时间,?,= V / FM,?,-,平均停留时间,（,s,）,V-,维持罐的体积,（,m,3,）,FM -,培养基的流量,（,m,3,/s,）,Note:,培养基在维持罐的流动不可能非常均匀，可能产生沟流，,造成一部分培养基在罐内的停留时间少于平均值。为保证,灭菌彻底，在设计罐式维持器时，通常取平均停留时间的,3,5,倍。,经