几种酵母转化方法

1、几种酵母转化方法酵母转化原理：像酿酒酵母 , 线性化的转化 DNA和 Pichiapastoris基因组的同源区域发生同源重组 , 使得线性化 DNA产生稳定的转化子（Cregg et al.,1985; Cregg etal.,1989）.这样的整合方式显示极强的稳定性 , 即使多拷贝转化子在没有选择压力的情况下也很稳定 . 单交换事件（插入）比双交换事件（置换）发生几率更大 . 单插入事件中约发生 1-10%概率的多插入事件 .电转化注意点：一、制备感受态的菌液收集时间：1、准确测定 OD值： OD在 1.2 1.5 之间。1） 为了准确测定 OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（ 1、 2

2、、 4、8、16 倍稀释，看其 OD值是否呈线性关系） 。每个倍数做 35 个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但 OD值不高，很可能 OD稀释倍数不够！2） OD 值是否测准也可以这样估算： OD600为 40 左右时，菌体湿重（ 6000rpm 离心 5min）约 0.95g/10ml 。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。2、75ml 的菌，经 18h 左右的培养，最后 sorbital 洗涤完毕后， 50ml 离心管里所剩菌体特别浓，需要 1mlsorbitol 才可溶解为糊状。正常培养的 OD在 1.2 1.5 之间的 500ml 菌液，收集的感受态也用 1ml 稀释

3、的，没那么粘稠。可以看看降低培养温度（ 27 摄氏度）或缩短培养时间（ 12h）。3 、甚至不用转接 , 直接挑单克隆在 50100mlYPD中摇过夜，效果也很好二、制备感受态的菌液量如果只转一个样品， 50ml 就够了，一般50ml 的培养液如果OD值正常的话够做10 管感受态的，其他的按比例缩小。用大试管摇5ml 菌液，然后取1ml 毫升在1.5mlEP 管中制感受态，每一步的离心时间30 秒就行。整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。三、感受态的保存感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因， 在冰上放

4、几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。 如果感受态细胞要保存， 不需要加甘油，一般 80ul EP 管分装， -70 或 -80 摄氏度保存。另附：酵母 GS115点种分离纯化接种 GS115于 5ml YPD 液体培养基， 30， 200rpm 振荡过夜，涂布 YPD 平板，30培养 48 小时，用 YNB基本培养基和含 His 的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划 YPD平板， 4 保存。四、电转化注意点：1、感受态做好后，最后一次吸出 sorbital 时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。

5、2、最后用毛细管取出100ul 出来，加入质粒，混匀！（怕量不够， 吸得很多，电转时效果反而不好。）3、电转杯清洁处理 : 一般先冲洗，洗净；然后浸泡在 75%的乙醇中；使用前我们都是放在超净台上，开启紫外，边吹风晾干，边进行紫外照射。电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。4、电击的时候，电压数以及电击时间可以摸索一下，适当增加电压或者延长电击时间都可以。电击条件比如 1.5kv ，放电 4.8 5.5ms。电击所有过程都要尽量在冰上进行，电击时间可以减少一点， 设置为 5ms左右，电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液，转移至 EP管，30 度静止培养 1h。如果菌体悬液浓度比较大的时

6、候，在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了。5 、电击之后，加入 1ml 的山梨醇，吸入 1.5ml 的 ep 管中，置于 30 度摇床低速培养 1h，再涂板。6 、注意的是处理液中的 DTT是在使用前加入，其它配好后于 4 度保存， DTT 单独于 -20 度保存，可配成 100 倍的贮备液。7、转化后 1ml 用 sorbitol 重悬的细胞悬液不能全部涂在一块板子上， 按标准程序制作的感受态一般 3 块左右可能比较合适， 以干燥后看见一薄层淡淡的白色为宜。转化子会在白色的薄层上长出圆韵、饱满的大菌落的。五、转化试剂和培养基的正确准备方法1、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候

7、吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。2 、YNB42度水浴一会，然后过滤除菌， YNB是加到培养基里面的，去离子水 pH 偏低，建议直接用蒸馏水就可以（关系不是太大） 。3、山梨醇，以及无菌去离子水均是冰冻，存放在4 度冰箱中4、一般用 10ug 以上质粒用 SalI 酶切，然后直接加乙醇沉淀， 70乙醇洗一遍，约 20ulddH2O重溶。转化效率一般大于 100 个克隆每 ugDNA。有人用 LiCl 和 DTT处理细胞，转化效率很高，可以试试。建议你不要用胶回收kit ，回收的 DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。5 个电转化方案方法一：高

8、效1. 收集菌体取 1mlGS115过夜培养物（ OD约 6-10 ） 分装到 1.5ml EP管中， 4、 10000g 离心 1min，弃上清，沉淀用无菌水（ 4）洗涤，同样条件下离心，弃上清。2. 菌体处理加入 1ml 处理液，室温下放置20min。处理液：10mM LiAc10mM DTT0.6M sorbitol10mM TrisHCl（pH7.5）3.离心，弃上清，加入 1ml 1M sorbitol，离心，弃上清，4.用 1M sorbitol 洗涤二次，到最终体积约为 80l. （菌体太多可适当弃去部分）5.加入 10 l. 经过 Bgl 酶切处理的工程质粒，混匀后转入电击杯中

9、，冰浴25min.6. 电转 . 1.5kv ，25 F， 200条件下进行电转。7. 电击后立刻加入 1mL 1M sorbitol ，吸出后于 30培养 2h。8. 取一定量涂平板（ YPDS+ Zeocin ，涂布的量分别为 100、200 微升，剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上）有一点要注意的是处理液中的 DTT是在使用前加入，其它配好后于 4 度保存，DTT单独于 -20 度保存，可配成 100 倍的贮备液。方法二：按下面步骤转化 , 开始每个板子只长了一二十菌落 ; 小细节修改后 , 每个板长了约 100 个.步骤如下：1、目的 DNA（pPIC9K），经电泳检测已经线性化（S

10、alI 酶切）；2、DNA 纯化方法是经酚仿氯仿两步抽提后，无水乙醇沉淀的，目测定量应足够；3、GS115甘油菌经新鲜平板复苏后，5ML培养过夜， 16h 左右后，取菌1： 100稀释，接种于 70ml 菌液扩大培养， 14h 后测得 OD600约 1.3 左右。4、将 sorbital、水和菌液均冰浴；5、菌液离心 5min 100ml 冰水洗涤 50ml 冰水洗涤 4ml sorbital洗涤，然后溶解于 300ul 冰 sorbital；6、加入约 510ug 的 DNA，枪吹匀，置 0.2CM电转杯静置 5min；7、电击， 1,5KV.8、立即加入 1ml 冰浴的 sorbital，

11、静止 10min。9、取 100ul 转化液，涂布10cm的 MD平板。做了一点修改每块板子大概能长100 来个菌落（一般需要2 天左右）：1、菌液收集时间：以前可能是OD值测得不太准确，我然后把菌液分别做了1、2、4、8、16 倍稀释，看其OD值是否呈线性关系。 1、菌液测 OD值时，建议将菌液稀释不同浓度测定，这样才准确些。菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能就是你的 OD稀释倍数不够！你分别稀释 2 倍、 4 倍、 8 倍、 10 倍等，每个倍数做 35 个重复，应该可以大致推断 OD值是否准确！2、我开始是先挑单克隆于 5mlYPD中，过夜 16h 后，转接于 50mlYPD中，培养大

12、概 18 个小时吧。 OD值是否测准可以这样估算： OD600为 40 左右时，菌体湿重（ 6000rpm 离心 5min）约 0.95g/10ml 。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。 测OD，用什么作空白对照呢？菌体稀释液，我一般使用 PBS3、电击条件等上面帖子上都有，1.5kv ，放电 4.8 5.5ms。2、其它做法相同，就是感受态做好后，最后一次吸出 sorbital 时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。3、最后用毛细管取出 100ul 出来，加入质粒，混匀！（我以前怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。 ）4、MD板子提前几天做好，放在冰箱里

13、，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。5、你说的 YNB，我用的是成品，只需要直接配制。 42 度水浴一会，然后过滤除菌。我没有加硫酸铵。 YNB是加到培养基里面的，去离子水 pH 偏低哦，我建议直接用蒸馏水就可以了（关系不是太大） 。3方法三：简便独特在筛选高表达菌种中，与大多数人和说明书有区别（成功做出几个基因）:每次转化前，均用多种酶 BlgII/salI/sacI同时切，转化时，用 GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样， 即 1.5/25/200,但是我用的是 0.1 的杯子，不是 0.2 的，转化后涂

14、MM及 YPD+0.25G，长出菌落后，即进行大规模的表达试验，直接用 YPD表达的，一般 48h 后即进行大量的 SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到目的带后再做 PCR，测序。方法四：没有转化子（无 aa 的 YNB和硫酸铵称好后，去离子水溶解，然后高压灭菌）1. 挑取酵母单菌落， 接种至含有 50ml YPD培养基的三角瓶中， 30、250-300rpm培养过夜约 14h，OD600约 1.32. 菌液离心 5min50ml 冰水洗涤 25ml 冰水洗涤 2ml sorbital 洗涤，然后溶解于 200ul 冰 sorbital ；两管分装，每管 100ul3.

15、加入约 510ug 的线性化的 DNA20ul，枪吹匀，置 0.2CM电转杯冰浴 5min；4. 电击， 1,5KV. 使用的是 Eppendorf 2510 ，用于转化细菌及酵母。5. 立即加入 1ml 冰浴的 sorbital，静止 1h。将菌体悬液涂布于MD平板上，每 300l涂布一块平板；方法五 :和说明书差不多的方法X33 菌株于 100ml YPD摇到 OD600约 1.1-1.3 ，太高影响感受态效率（ 1） 1500 1700g 离心 5min，将离心管倒置在吸水纸上轻轻控几下，充分弃上清（ 2） 加入 100ml 冰浴的超纯水 ddH2O，可在振荡器上振荡混匀，可静置 35分

16、钟（ 3） 离心，弃上清，再加 100ml ddH2O洗一遍（ 4） 离心，弃上清，加20ml 冰浴 1M Sorbitol洗一遍（ 5） 离心，弃上清，菌体置于冰浴中，加入约100200ul Sorbitol混匀加入 Sorbitol量需自己调整，这时菌液很浓，只要能够用200ul 黄枪头吸出来就可以了，一般共有约400500ul ，够做几管感受态了。（ 7） 吸取 100150ul 感受态到线性化的DNA中，用枪头打匀或手指弹匀静置 5min，于 2mm电转化杯中，电击参数： 1.5KV，25uF，200 欧姆（不是 400），一般放电时间在 4.5-4.9ms 之间，小于 4 说明你的

17、DNA盐浓度太高（ 9） 立即加入 1ml Sorbitol ，转入 10ml 离心管， 30 度静置 1 小时，然后加入 1ml YPD，30 度， 200rpm 摇 1 小时，取 50200ul 菌液涂 100ul/ml YPDS 板（ 10） 一般转化效率可以达到： 200 个以上转化子每 200ul 菌液，足够筛选表达菌株了。方法六 : 酵母感受态细胞的制备 接种 PichiapastorisGS115于 5 ml YPD液体培养基，30，250300250 rpm ，过夜。 取 200l的培养物接种至含有 500ml 新鲜培养基的三角摇瓶中， 2830、 250300r/min 培养

18、过夜，一般 12 小时左右。4 将细胞培养物于 4， 5000g 离心 5min，用 500ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；按步骤 3 离心，用 250ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；按步骤 3 离心，用 20ml 的冰预冷的 1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬； 按步骤 3 离心，用 1ml 的冰预冷的 1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为 2ml； NOTE：可将其分装为 200l一份的包装冷冻起来， 但如果保存时间过长会影响其转化效率。化学转化毕氏酵母氯化锂转化法试剂1. 1M LiCl ：用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释2. 50% PEG33

19、50 ：Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装3. 2mg/ml salmon sperm DNA / TE （10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA ）-20 保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效； PEG3350可屏蔽高浓度 LiCl 的毒害作用；毕氏酵母的转化1.煮沸 1ml 鲑鱼精 DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；2. 将感受态酵母菌离心，以 Tips 去除残余的 LiCl 溶液；3. 对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链 Sa

20、lmon sperm DNA 25ul510ug/50ul H2O质粒 DNA 50ul4.剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；5. 30 水浴孵育 30min；6. 42 水浴热休克 2025min;7. 6000 8000rpm 离心收集酵母菌体；8. 重悬酵母于 1ml YPD培养基， 30摇床孵育；9. 14h 后，取 25100ul 菌液铺选择性培养基平板，于 30培养 2 3 天鉴定（将表达菌株和对照菌株在固体培养基平板， 30c 培养至转化子出现）毕氏酵母 PEG1000转化法试剂缓冲液 A：1.0M Sorbitol ，10mMBicine ，pH8.35（si

21、gma）,3%（v/v ）ethylene glycol缓冲液 B： 40%（ w/v ）PEG1000（sigma），0.2M Bicine ， pH8.35缓冲液 C： 0.15M NaCl，10mM Bicine ，pH8.355未污染的新鲜、试剂级DMSO， -70 保存注： 1.缓冲液 A、B、C均用滤膜过滤， -20 保存 ;2. 将 DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞， 其摄取外源 DNA的能力也在解冻过程中迅速下降； 如进行多样品的转化，建议按 6 样品 / 组进行） ;待转化毕氏酵母的制备1.接种环接种 Pachia pastoris于 YPD平板， 30培养 2d;