一组第一篇翻译Oxidative biotransformations using oxygenases

1、利用加氧酶的氧化生物转化Oxidative biotransformations using oxygenasesZhi Li*, Jan B van Beilen*, Wouter A Duetz*, Andreas Schmid*, Anna de Raadt, Herfried Griengl and Bernard Witholt*利用加氧酶的人工氧化生物转化已经获得了很大的进步。底物接受，催化活性，区域选择性和立体选择性已经通过底物工程，酶工程或生物催化筛选得到了很大的提高。通过使用野生型的全细胞或重组菌株，生物转化制备已经在克到数百克的规模下被用于合成有用的药物中间体或手性结构单元

2、。通过NADH或NADPH的酶或电化学再生，加氧酶在体外的合成应用已经成为可能。简介（李新亮）加氧酶的氧化生物转化在化学上非常重要主要有三个原因：1.他们的化学相关品不存在或不具有所需要的区域和立体选择性2.他们用氧作为便宜的，环境友好的氧化剂，而不是有毒的化学氧化剂3.他们能被用于准备手性积木和药物中间体或修饰具有生物活性的天然产物单加氧酶利用分子氧插入一个氧原子到一个底物，然而第二个氧原子被NADH或NADPH的电子还原产生水。这个相对复杂的反应通常需要一个金属中心，从还原的辅酶的电子传递通常需要另外的蛋白质。双加氧酶的区域和立体选择性催化插入分子氧的两个氧原子到一个底物。他们可能是辅酶依

3、赖或不依赖。实际上，生物氧化通常在体外用生长的或休眠的细胞进行。他们也能用纯化的酶在体外进行，证明需要的辅酶能够原位再生。在这篇综述中，我们关注于2000年11月1日后的有用的加氧酶反应在合成应用上的新的进步。此文排除了由细胞代谢和反应的如P450酶催化的大量的氧化过程。不活泼碳原子的羟基化（牛贺）底物工程以提高已知的生物羟基化反应能力为目的的底物修饰已经通过D/P（docking/protecting）的概念被证明了。运用这个概念，一些本来不会产出产品的分子质量小的物质，例如醛类，酮类，羧基酸，醇类被微生物系统羟基化了。手性的助剂第一次作为D/P用于提高物质的立体选择性。例如，ATCC715

4、9对环戊酮和4-甲基-2-戊酮的羟基化。苯甲基类物质也被当作一种d/p运用在醇类的羟基化中。底物工程研究也证明，Sphingomonas sp. HXN-200对吡咯烷9及吡咯烷-2-酮11的羟基化对于准备对映纯的3-羟基吡咯烷10和4-羟基吡咯烷-2-酮12这两种有用的药物中间体是有作用的。改变底物的取代基可以很明显的提高羟基化活性和立体选择性，导致10的立体构型实现互补。简单的结晶化使10的两个异构体都达到高度的对映体过量（ee）。很容易控制以及高效的冰冻/解冻Sphingomonas sp. HXN-200的细胞并用于9的羟基化，从而得到高产量的3-羟化吡咯环10。用生长着的细胞也可以达

5、到相近的产量。有趣的是，实验证实烷烃单加氧酶在该菌株里是可溶的，这与著名的膜结合的Pseudomonas putida GPo1的烷基羟化酶形成对比。自然产物自然产物羟基化的区域选择性和立体选择性的最好代表性反应是，用Aspergillus niger ATTC9142将蜜叶辛木素羟基化为3-羟基蜜叶辛木素。Streptomyces sp. MA 7065对紫杉醇/三尖杉宁的生物转化导致在10-乙酰甲基和侧链苯环上的羟基化。蛋白质工程（袁琪）蛋白质工程和定向转化允许以提高酶活和底物范围等酶系数为目的操纵酶。这些方法已经用于P450cam和P450 BM-3(CYP102)因为详细的三维结构是可

6、得到的，两种酶清楚地优势在其他的P450 BM-3在不同主体中可溶性和良好表达性。在这两个情况中，酶的活性位点改变为能容纳天然酶很难氧化的化合物。当野生型的P450 BM-3有一种更窄的底物特异性在那些主要长在C12和C18之间初等脂肪酸中，命名在w-1,w-2,w-3位置，BM-3变体氧化链烷，环烷，芳烃和杂环，多环芳烃，和中长链脂肪酸。P450cam变异产生于转化多氯苯到酚。这些例子清楚的表明这令人兴奋的合成方法允许特制的酶的准备。苄基和烯丙基羟基化成功的区域选择性和良好的立体选择性是Bacillus megaterium羟基化的丙基苯到R-16。细胞用于在藻酸纤维的固定化以提高细胞的固定

7、和产品形成。不幸的是，产品浓度太低。从Pseudomonas putida F1克隆的p-cymene单加氧酶羟基化苄基被报道，但仅用于检测底物范围。另一方面，一些烯丙基的羟化反应用于合成。通过筛选一些甲苯降解菌，Rhodococcus opacus PWD4被发现特异性羟基化D-limonene的6位置，提供大量对映纯的(+)-trans-carveol。抗真菌鲜黄菌内酯A和B在21位置被Micromonospora sp烃基化。Catharanthus rosens 对紫苏醇的羟基化提供了很好的产量。芳香化合物的羟基化（王腾）芳香碳原子羟基化的新发展已经关注体外的应用。来自Pseudomo

8、nas mendocina KR1的甲苯4-单加氧酶是一个四组分的复杂的酶，测试了其在有机溶剂/水缓冲溶液混合物中的羟化作用。该酶保留了活性和区域选择性，甚至底物范围都扩大了。在反应持续超过3 min后会观察到羟化酶组分的不稳定，以及NADH的利用和产物形成间的明显的非耦合性。此外，2-羟基联苯3-单加氧酶 (HbpA) 是一个单组份的酶，能够催化2-羟基联苯特定选择性地羟化为2,3-二羟基联苯，发现它在有机溶剂/水缓冲溶液混合物中也是相对稳定的。用纯化的HbpA成功地将2-羟基联苯羟基化，用甲酸脱氢酶 (FDH) 再生NADH。在两相系统中避免了底物和产物的抑制作用。单位体积的生产力达到了0

9、.45 g/L/h，比体内过程的 (0.39 g/L/h) 稍多。在另一方法中，体外羟化过程用破碎后的HbpA在水缓冲溶液中进行，用Cp*Rh(bpy)ClCl复合体进行间接的电化学NADH的再生 (bpy为2,2-吡啶)。单位体积的生产力达到了0.20 g/L/h，代表了间接电化学NADH再生的单加氧酶的首次合成应用。BaeyerVilliger 氧化（唐溪）对BaeyerVilliger单加氧酶的最彻底的研究是Acinetobacter sp. NCIMB 9871 环己酮单加氧酶(CHMO)，该酶已经显示出能氧化超过100种酮类的能力，而且通常拥有卓越的区域性选择性和催化反应选择性。最近

10、有一个酶催化反应选择性的影响的研究，也有另外的几个针对酶产物的报告。CHMO同时也被应用于试管合成对映体纯内酯，这种内酯是有趣的自然生产的原始化合物，而且NADPH伴随着蛋白质工程FDH的改造。已氧化好的对称的4-取代和4,4-双取代的环己酮25与表达CHMO的整个大肠杆菌的细胞混合。在很多情况下，产量和26的ee是令人满意的。使用杂环的酮类也能得到相似的产量。环氧化作用对C=C键的生物催化环氧化作用是用加氧酶和过氧化物酶，经常产生高的对映体过量。过氧化物酶使用H2O2作为氧化剂，导致酶活性缺乏稳定性过程并形成副产物，原因是酶对环氧化物的进一步的氧化。酶工程很大程度上能克服这些限制因素。加氧酶

11、使用在活性位点活化的分子氧作为氧化剂，可以明显减少不确定的副反应。想要获得高产量的产物和高进程的生产力，产物的原位复原是必须的，因为环氧化合物在含水系统中是不稳定的，而底物和环氧化合物能在高浓度时抑制催化剂。两相系统提供了解决这些限制的方法，而且能在基于膜反应器的基础上，在反胶束或者乳液系统中，Pseudomonas oleovorans连续不断地环氧化1,7-辛二烯到(R)-1,2-epoxyoct-7-ene。前两个过程概念避免了直接接触有机相生物催化剂但是显示出低容积的环氧化反应生产力，可能归因于转移相的限制。在有机含水乳剂中，全部的细胞生物催化剂直接接触有机相，而这必须应用有微量毒性的

12、有机溶剂。使用加入一些手性环氧乙烷到最高活性到20U/g CDW和1.8g 产物/g CDW的2升规模中成功的解决了问题。对苯核环氧化作用产物的首次隔离最近报道出来；小规模用白色的腐烂的真菌Phellinus ribis从methyl 2-trifluoromethylbenzoate中获得的稳定的6-trifluoromethyl-1,2-benzeneoxide，并且用6-trifluoromethyl-1,2-benzeneoxide化学转化到anti-benzene dioxide。生物催化的环氧化作用只能被应用到大规模和经济的生产，除非催化剂和工艺流程设计小心的转化到失去活性的易变的

13、水相产物和反应物的操作。脂氧合酶的过氧化反应（黄益养）脂氧合酶是特定条件下催化氧气到不饱和脂肪酸并产生手性1,3-二烯反式脂肪-5-磷脂氢过氧化物的的血红素铁双加氧酶。这种酶是无约束的辅助因子，故在细胞系统中容易使用。除此之外，亚麻油酸自然底物催化常数比烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或从属还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单加氧酶和双加氧酶平均量级高两个或三个量级或者更高。然而，一个限制其实际使用的原因就是在底物中必需含有的一部分1,4-戊二烯。否则，就如最近许多文章所表示的许多脂氧合酶的底物范围很广。对于黄豆15-脂氧合酶和马铃薯5-脂氧合酶38而言嵌入氧或硫原子或者羰基或氨基酸酯功能团到底物而修改链长都是可

14、行的。一系列的合成类似物的亚油酸如含一个乙醇基团终端而不是一个羧基基团的混合物同样被证明是黄豆15-脂氧合酶极好的基底（图5a）。在33氧化中可获得极好的区域选择性（）97:3）和立体选择性（94-96%）。在良好的总体产量下可降低含三苯基磷过氧化物媒质34或山葵过氧化酶40产生的相应醇类35。这些结果同样表明羧基基团不是酶活性性能所必须的，而区域选择性主要取决于近端单位的疏水内容（一个烷基链）。脂氧合酶在有机溶剂中的适用性正在研究中。一个单相异辛烷（iso-octane）中介物的使用导致2,6-折叠而使黄豆15-脂氧合酶的活性趋类似于亚麻油酸41。含辛烷或异辛烷的两相系统同样起到使总体没活性

15、的提高的作用。使用各种不同底物对大豆脂氧合酶的作用是研究并提高酶稳定性的重要方法。CNBs琼脂糖4B和Fractogel EMD Azlatoneshi 是研究该酶活性和稳定性的最好物质。离子化条件如pH和离子强度似乎强烈的影响固定酶的半衰期。最后，在每克蘑菇中含380ug产物脂氧合酶和氢过氧化裂解蘑菇酶用来转化亚麻油酸为香味混合物1-octen-3-ol。Dihydroxylation双羟基化反应（许炳雯）双加氧酶将芳香化合物顺式双加羟，产生相应的顺式-二氢二醇芳香化合物。与脂肪氧合酶不同的是，这种双加氧酶是NAD(P)H依赖型酶。双加羟是生物处理过程中应用的一个重要的过程。利用Alcali

16、genes eutrophus(真氧产碱杆菌)在80L体系中将苯甲酸双加羟，生成270g（1S,2R）-1,2-二羟基环己二烯-3,5-二烯-1-羧酸，是利用双加氧酶生成产物最多的报道。所生成的酸可以转化为一些具有高度对映官能团的环己烷羧酸衍生物。传质条件一直都是萘生物转化率的限制条件，利用含有无离子表面活性剂的直接胶束体系，可以提高萘的生物转化率。因此，利用含有Pseudomonas fluoresceens N3萘双加氧酶基因的基因工程菌JM109，可以使10mM萘定量转化为顺式-(1R,2S)-1,2-二氢-1,2-二羟基萘。为了避免毒性底物的抑制作用，在菌株Pseudomonas putida UV4使甲苯双加羟的过程中，通过对氧气摄入率的测量来控制底物的供应。Review综述（孔春雷）利用加氧酶控制氧化性的生物转化已经取得了相当大的进展。底物特异性、催化活性、区域选择性和立体选择性明显改善了底物工程、酶工程或生物催化剂。制备生物转化通过利用野生菌株全细胞或重组菌株，实现了有用的制药中间产物或手性合成纤维一克至数百克规模的合成。加氧酶在体外的合成应用已被证明可能是NADH或NADPH的酶或电化学再生。Conclusion结论总之，利用加氧酶的区域选择和立体选择的氧化反应已被证明是非对称合成中的有用工具。底物工程与“d/P组”的概念成功地