图位克隆原理及应用.ppt

1、图位克隆技术的原理及其在分离玉米基因中的应用,刘朝显 2010.11.3,2,内容摘要,一. 图位克隆技术的基本原理,图位克隆（Map-based cloning）: 定位克隆（position cloning）,1986 年首先由剑桥大学的Alan coulson 提出。 正常遗传学 基本原理：根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因精细定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，通过染色体步移(chromosome walking)逼近目的基因或通过染色体登陆(chromosome landing)方法最后找到包含有该目的基因的克隆，最后经

2、遗传转化试验证实目的基因功能,3,图位克隆技术的优越性与局限性 优点：不需要事先了解目的基因的表达产物，这为克隆 许多有重要经济价值的农作物基因提供了有效的 手段，因为这些基因的产物大多都是未知的。 缺点：基因组中的重复序列导致染色体步移困难，甚至 将步移引入歧途,4,一. 图位克隆技术的基本原理,4. 图位克隆示意图,5,一. 图位克隆技术的基本原理,连锁标记的筛选,初定位,精细定位,M3,M4,M5,M6,M7,M8,合成探针筛选基因组文库,转基因功能验证,BSA，NIL,300左右,5000左右,二. 图位克隆的技术环节,6,1.定位群体的构建 亲本选择原则:选择高度纯合，遗传差异大，D

3、NA多态性 丰富的亲本（实现基因精细定位的重要前提） 可选用多个亲本进行多态性筛选 定位群体的组配：基因的定位是基于分离后代中交换单 株出现的频率大小而实现的，因此组配一个遗传信息多 群体大小适中的分离群体尤其重要。 BC1,F2 非永久性群体 群体类型 RIL,DH，NIL 永久性群体,2. 初定位(玉米：100-350株) 近等基因系（near-isogenic line,NIL ）法: 近等基因系是指几乎仅在目标性状上存在差异的两种基因型个体, 这可通过连续回交的途径获得。由于NILs 的遗传组成特点, 一般凡是能在近等基因系间揭示多态性的分子标记就极有可能位于目标基因的两翼附近,7,二

4、. 图位克隆的技术环节,Chromosome landing: a paradigm for map-based gene cloning in plants with large genomes. Tanksley et al.1995,8,二. 图位克隆的技术环节,集团分离分析法（bulked segregant analysis, BSA）: 将分离群体中研究的目标性状根据其类型(如抗病、感病)分成2组，将每组内一定数量的植株DNA等量混合，形成2个池，这2 个池仅在目标性状(如抗病性)上有差异。利用分子标记技术寻找2 个池的扩增谱带的差异，这种多态性极可能与目标基因连锁,9,Chrom

5、osome landing: a paradigm for map-based gene cloning in plants with large genomes. Tanksley et al.1995,10,M1,M2,二. 图位克隆的技术环节,P1,P2,F1,P2,BC1,初定位示意图,3. 精细定位（玉米4000株,11,二. 图位克隆的技术环节,MarkerI,MarkerIII,MarkerV,MarkerVI,MarkerIV,MarkerII,Target gene,上游交换单株,下游交换单株,4. 构建高质量、容易操作的大片段基因组文库 在基因的图位克隆技术中，高质量的基因

6、组文库的构建也是克隆成功的关键。 YAC: 插入片段大（100-2000Kb）,加速染色体步移; 嵌合情况严重，遗传不稳定，插入片段内部重 排或者缺失，插入片段分离难，转化效率低。 BAC：片段插入一般在150Kb左右。嵌合现象少，以 大肠杆菌为寄主，转化效率高，提取容易，用 途广泛。 柯斯质粒文库：兼具了质粒和噬菌体两方面的特性 插入片段最大可达45kb,12,二. 图位克隆的技术环节,5. 鉴定目标基因 利用与目标基因连锁的分子标记筛选基因组文库（PCR反应或者菌落杂交），鉴定阳性克隆，并进行亚克隆测序，预测基因，确定候选基因。 候选基因的确定： （1）比较候选基因序列在野生型与突变型之间

7、的差异，确定 在二者之间变异的cDNA 序列; （2）证实候选基因的时空表达模式与目标性状的表现相同; （3）转化候选基因，进行遗传互补实验，这是最直接、最终 鉴定基因的方法,13,二. 图位克隆的技术环节,三. 图位克隆在分离玉米基因中的应用,1992 年应用图位克隆技术首先在拟南芥中成功分离基因ABI3和FAD基因。 随后利用图位克隆技术又成功的从拟南芥、水稻、大麦、玉米和番茄等植物中克隆到了多个基因。 随着测序技术的发展，拟南芥、黄瓜、水稻、玉米、高粱、大豆等植物的基因组测序已经完成，海量的SSR、SNP、In/Del、CAPS、dCAPS分子标记大大促进了图位克隆的速度,14,15,三

8、. 图位克隆在分离玉米基因中的应用,三. 图位克隆在分离玉米基因中的应用,sparse inflorescence1 encodes a monocot-specific YUCCA-like gene required for vegetative and reproductive development in maize (Paula Mc Steen et al. PNAS.2008) 玉米突变体基因Vg1 (Vestigial glume)的图位克隆,16,17,Position cloning of spi1,Mutant Phenotype,18,spi1 Alleles : Th

9、e spi1-ref allele was identified in a Mutator transposon mutagenesis screen. spi1-125 and spi1-E914 were obtained from the Rescue Mu population spi101-00816 was originally identified in an EMS screen,19,Materials,Materials,20,F2 population (spi1 :spi1 210 mutants,Mutant (spi101-00816) B73,F1,F2,Methods,The spi101-00816 mutant was initially ma