分子标记SSR标记 文档

1、SSR,标记,一、简介、原理,二、多态性基础,三、开发、前景,主讲人：,高慧,一、,SSR,标记,原理,?,简单序列重复,(single sequence repeat,）,简,称,SSR s),或微卫星,(m icrosatellite),序列大量地存,在于大多数真核生物及部分原核生物基因组的非,编码区和编码区中，由串联的,1- 6,个核苷酸重复,片段构成，长度一般在,100bp,以下，具有长度的,超变性,。,?,原理,:,与微卫星序列相邻的两侧区域保守性通,常较高，可以在此保守区域设计一对特异的,PCR,引物，扩增其中的微卫星序列，通过聚内酞胺凝,胶电泳，即可显示出个体间在此位点的微卫星序

2、,列的多态性。,二、,SSR,标记,多态性基础,?,目前研究过的所有植物中均存在着,SSR,多态性。绝大多数作物，,如大豆、水稻、小麦、玉米、大麦等中，,SSR,位点上的等位基因数目,可多达十几个乃至几十个，个别作物多态性水平较低。和其他,DNA,分,子标记相比，单个,SSR,位点检测到的,等位基因个数,和,多态性指数,(diversity index,，用,1- E,可表示，其中,P,为某一位点第,i,个等位基因,),是,最高的。,?,对人类,SSR,的研究表明，,核心序列的重复次数与,SSR,的长度多态,性,有密切关系。重复次数增加，,SSR,的长度多态性增高。这一趋势也,在一些作物中得到

3、证实。,不同重复类型,SSR,多态性水平存在差异,，二,核苷酸重复构成的,SSR,多态性水平要高于其他类型。同一类型,SSR,的,不同位之间，其多态性水平也不一样。有些种类,SSR,位点其多态性水,平明显高于其它位点,.,如在大豆的研究中发现,7,个,(ATT) n,位点等位基,因数目可多达,11-26,个,;,由,AT,重复构成的,SSR,甚至可区分遗传基础极其,狭窄的日本梗稻育成品种。,(TAA/ATT) n,类型,SSR,是小麦基因组中最,丰富、多态性最高的三核苷酸重复类型,SSR,。但因,(AT)n,类型寡聚核,苷酸探针容易形成二级结构，降低了筛选效率，影响了这一类型,SSR,的分离,

4、.,然而现有研究表明，,(AT)n,类型,SSR,仍是可以分离的。,SSR,标记的优势,?,与其他分了标记如,:,如,RAPD ,RFLP,等相比，,SSR,标记具有以下的,优点,:,（,1,）在植物基因组中大量地、随机地分布，具有广泛的位点变异，,揭示比,RAPD , RFLP,更多的多态性,.,?,（,2,）,SSR,标记揭示的是单个位点上复等位基因的信息，为共显性,标记，能够区分纯合型和杂合型，提供完整的遗传信息,.,?,（,3,）微卫星序列多态性可以用,PCR,方法检测，不需要过多的分了,克隆乎段，对,DNA,模板的要求不高，重复性好,.,因此成为在植物中日,前运用最广泛的分了标记之一

5、，广泛地运用于植物种质鉴定、分了标,记连锁图的构建和群体遗传学等诸多领域,.,?,但是微卫星标记存在一个重要的,局限性,就是微卫星序列两侧区域,在种间保守性往往较低,.,种间扩增微卫星标记仅仅局限于同一个属或相,近的属的不同物种间的扩增，这大大限制了,SSR,标记在其他物种中的,运用现在有一些从微卫星序列衍生而来的其他分了标记，不用分离单,个微卫星位点而获得多个位点指纹图谱，如,LSSRs,、,SAM,等，但,由于多位点微卫星指纹图谱带型复杂，难以确定等位基因，大多为显,性标记，这限制了它们的运用的范围,三、,SSR,标记的开发,?,传统用于克隆单位点微卫星序列的方法包括以下步骤,:,?,(1

6、),构建小片段或大片段的基因组,.,?,(2),筛选阳性克隆,.,通过传统的影印或挑单菌落点膜的方,法，把克隆转移到尼龙膜上，经过固定后，用标记过的序,列重复寡核有酸或含微卫星序列的探针与尼龙膜上的克,隆点杂交，筛选出其中的阳性克隆,.,?,(3),测序、设计引物、优化,PCR,反应条件,.,获得的阳性克,隆经过确认后，全部或经过随机挑选后测序，然后根据微,卫星序列两侧保守区域的序列设计引物，优化,PCR,扩增的,条件，获得稳定、可靠的,SSR,标记。,微卫星标记分离技术,?,为,了避免筛选文库，现在有一些与其他成熟技术结合的分离微卫星标记的方法，包括,:,?,（,1,）运用,RAM P,和,

7、RA PD,技术分离单位点微卫星标记,?,RAM P,利用,5,含有四个锚定碱基的微卫星引物结合不同的,RA PD,引物在基因组,DNA,中扩增，获得片段包括两头带反向微卫星序列的扩增片段,(,为,USSR,产物,),、随机扩增的,片段,(RA P,产物,),、随机引物与微卫星基因座间的片段,(SSR,产物,).,用标记的,5,锚定引物扩,增或经,Southern,后在用标记的微卫星探针与之杂交后，再经过自显影，可以得到只含,微卫星标记的指纹图谱,.,在,RAM P,和,RAPD,技术的基础上，人们运用,RAM P,技术和,RA,PD,技术扩增基因组,DNA,，得到扩增产物，然后用标记的微卫星

8、的探针与,PCR,产物,Southern,杂交或用标记微卫星锚定引物，在,PCR,扩增后胶上直接观测，选择阳性条带,克隆,22 i,、或者首先克隆所有的,PCR,产物，制成微列阵，然后筛选克隆。,?,( 2),利用,1SSR,技术分离单基因座微卫星序列,?,1SSR,是,1994,报道的一种方法,.,这种方法是用,3,或,5,端带有,1,一,4,个锚定碱基的微卫星引,物，来扩增基因组获得在两端带有相反排列的微卫星序列的,DNA,片段，经电泳后，显,示复杂的指纹图谱,.,用,1SSR,引物在基因组,DNA,中扩增，获得,1SSR DNA,片段，然后克,隆，经测序后，根据微卫星序列间的,DNA,序

9、列设计两个巢式引物,.,然后运用巢式引物用,“步查”的方法在不同酶切片段的基因组文库中扩增，直至获得微卫星序列的另外一,侧的序列，再设计微卫星位点另一端的引物。,5,锚定,PCR,分离,SSR,标记,?,（,3,）采用,5,锚定,PCR ( 5,-anchored PCR),分离,SSR,标记,?,采用的,5,带有,六个简并碱基,锚定的微卫星序列引物,.,这种引物锚定效,果要比,1SSR,技术中的随机锚定引物的特异性好，避免了引物在微卫,星序列上的滑动,.,然后用这个单引物在基因组,DNA,中,扩增,，得到两端,带有,反向,微卫星序列,DNA,片段，用,T,载体,克隆,PCR,产物，然后用,S

10、outhern,杂交,的方法，在高严谨度的条件下，获得含微卫星序列的克,隆，然后对这些阳性克隆进行,测序,，根据获得的序列，在微卫星序列,的侧翼,设计引物,，用,5,锚定简并引物结合微卫星特异性引物，经扩增,后获得,单位点的,SSR,标记,.,?,也可以通过步查获得微卫星序列另一侧的序列，并设计另一个引,物，然后用成对的特异性引物来扩增单个微卫星位点,.,5,锚,定,PCR,技,术有两个明显的优势，其一，可以简单而快捷地建立,SSR,富集文库,.,第二，对于大多数位点仅仅需要一个特异性引物就可以获得位点特异,的共显性标记。因此在以后开发的分离单位点微卫星序列的方法中很,多都运用了这种引物,.,

11、SAM PL,技术分离,SSR,标记,?,SAMP,是,Witsenboer,等,2019,创立的一种分离微卫星标记的技术,.,它,同,AFLP,一样具有择性碱基的,AFLP,引物,接头的连接,和,预扩增,的过程,.,但是在第二步选择性扩增时，运用的是一个,末端,带有,3,个选物和,5,锚定,微卫星引物的组合进行,PCR,扩增,，通过,电泳,获得多位点的微卫星图，,通过不同的,A FLP,引物和,5,锚定引物的组合，可以揭示基因组,DNA,的,所有微卫星位点的多态性,.,?,然而用这种方法获得的,大多是显性标记,，共显性标记占少数，因,此有必要把具有重要信息的位点转化为带有有用信息的微卫星标记

12、，,基于这种想法,H ayden Sharp( 2019),发表了一种改良,SAM PL,程序，,获得,SAM PL,图谱，在分了标记连锁图上定位,SAIVI(se-ectively,anplified m icnsatellite),位点选择有兴趣的,SAP,位点，然后有选择的,克隆、测序，根据这个微卫星序列一侧设计一个特异性引物，用与,F,fisher( 2019),相同的方法来获得单位点的共显性的微卫星标记,.,构建富集微卫星序列的基因组文库,?,构建富集微卫星序列的基因组文库是现在分离单微卫星位点的主要方法，它与传统方法不同在,于有一个富集微卫星序列的步骤，按照富集方法的不同，主要有两

13、种方法,:,?,引物延伸反应富集微卫星序列,?,它的大致步骤为,:,首先建立以噬菌粒或,M13,噬菌体为载体的小片段基因组文库这种文库叫初级,文库,.,然后用辅助噬菌体、超感染初级文库，产生单链环状,DNA,，以单链,DNA,为摸板，用微卫,星序列为引物合成双链,DNA,，,然后富集双链,.,其卞要步骤如下,:,?,（,1,）经酶切的基因组,DNA,与噬菌粒相连，连接产物转化大肠杆菌菌株，构建初级文库,.,在这,种菌株,.,由于缺乏,(IUT-P ase,和,UDG(,尿哈陡一,DNA,糖基化酶,),，在复制过程中,(IUTP,可以有效地,代替,cIITP,掺入,DNA,中而不会被修复系统修复

14、，因此可以积累含,(IUTP,的,DNA.,?,（,2,）用,M13,辅助,I,体超感染初级文库，产生富含,(IUTP,的单链环状,DNA,，并分离出这种单链,环状,DNA.,?,（,3,）以单链环状,DNA,为模板，以微卫星序列为引物用,PCR,方法对含微卫星序列的,DNA,进行,延仲，这样双链,DNA,大多数是含微卫星序列的,.,?,（,4,）转化这种反应产物到,(dut ung,的野生型菌株，由于单链,DNA,的转化率低，转化得到的克,隆大部分为双链,DNA.,由于在此菌株存,(IUTPase,和,U DG,可以利用自身的修复系统以双链,DNA,n1:,常链为模板替换另一条链中,(IUT

15、P,替换为,cITP,可以得到复制,.,而经转化而来的少量的单链,环状,DNA,由于尿哈陡一,DNA,糖基化酶降解,cIUTP,的作用，得不到有效的复制,.,这样构建出的文,库中就富集了很高比率的含微卫星序列的克隆,.,?,选择杂交法富集微卫星序列,?,这是现在很多研究人员采用的方法,.,它,在传统构建基因组文库的基础上加上了选择杂交富集,含微卫星序列的片段、,PCR,扩增的过程,.,杂交的方法有两种,:1),把含有核有酸重复的探钊或寡,核有酸重复序固定在尼龙膜,9.2),把核有酸重复的探针,1,、寡核有酸重复序列的,5,端生物素化，,然后固定在带有链霉亲和素的磁珠上,.,通过杂交、洗脱非特异

16、杂交,DNA,片段后，再用,PCR,扩增,富集洗脱的特异杂交的片段，然后转化大肠杆菌，构建富集微卫星序列的基因组文库。,STMP,?,STMP,技术一种快速、高效分离,SSR,标记的技术,?,STMP(Sequence,一,tagged m icnsatellite pnfiling),是,H ayden,( 2019,年,),在,Nucleic acxlresearch,发表的文章中介绍的一种方法,.,它利用,SAGE ( serial analysis of gene expressxn),原理，建立含微卫星序列,标签文库，可以快速大通量,(,比常规高,25,倍,),的分离单位点微卫星序列

17、,.,它通过,扩增,含有微卫星序列片段，再用限制性内切酶在识别位点下游,酶切,这些片段，产生了标签序列,.,虽然这段序列仅有,16,饰但却可以区分,4 3x10,倒,6),个不同的微卫星位点，大大超过了在植物中估计含有的微卫,星位点的数日,.,然后把这些,标签序列连接,起来形成串联体，再把它,连接,到载体,上，经,测序,后，获得串联体中各个标签的序列,.,由于在一个载体,上串联有平均,25,个左右的标签，所以一个克隆就可以鉴定出多个微卫,星位点,.,在串联体中标签和标签间由一段序列,(,内切酶识别序列,),来标志，,这样就可以分辨每个标签和标签的方向,.,每个标签长度足够设计引物可,以用在基因

18、组,DNA,或在酶切的基因组,DNA,扩增片段池中分离,SSR,标记,了,.,它包括,:,双酶切、加接头经,PCR,扩增产生带有,PstI,M seI,头的扩增片,段、用接头引物与微卫星锚定引物扩增带有微卫星序列的片段、富积,带有微卫星序列的扩增片段、用且,s,型限制性内切酶酶切产生标签序列,(,啤,),、在,3,一端加上,B sgl,接头并扩增、用单酶切,(EcoRl),在标签两端产,生粘端、连接标签形成串联序列、克隆及测序,.,前景,计算机自动化,?,以前寻找,SSR,的方法是通过构建文库，合成短重复序列分子标记做,Southem,杂交，,然后将,SSR,两端序列测出来，再设计引物，筛选多态性，将分子标记整合到遗传图谱,上,.,周期长,，,费用大,，所以有必要在以后基因组时代使用基于全基因组的,计算机自动化,SSR,标记筛选方法,。因而有必要充分的利用不断增加的基因组序列数据资源。通过这,个项目能够建立一整套的,SSR,分析方法及软件开发的流程，并且绘制出水稻全基因组,的遗传图谱。,SSR,标记与,AFLP,、,RAPD,等标记均是以,PCR,为基础的分子标记，但