分子生物学：第五章 原核基因的表达与调控

1、第五章原核生物基因的表达与调控,Expression and regulation of genes in prokaryotes,本章内容,第一节 原核基因表达调控概论 第二节 乳糖操纵元与负控诱导系统 第三节 色氨酸操纵元与负控阻遏系统 第四节 其它操纵元及其调控机制 第五节 转录水平的其他调控方式 第六节 原核生物的转录后调控,第一节 原核生物基因表达调控概论,一、原核基因表达调控的环节 二、操纵子学说 三、原核基因表达调控的类型与特点 四、弱化子对基因活性的影响 五、降解物对基因活性的调节 六、细菌的应急反应,基因表达 （Gene expression）： DNA 到蛋白质的过程 基因

2、表达调控（Regulation of gene expression）： 对基因表达过程的调节,基因表达的调控系统： 不同生物可使用不同信号和机理来调控基因表达 原核生物: 营养状况，nutritional status 环境因素，environmental factor 真核生物： 激素水平，hormone level 发育时期，developmental stage 基因表达方式： 组成型或永久型表达，constitutive expression 诱导型或适应型表达，induced or adaptive expression,原核与真核生物转录及翻译调控的比较,细菌: 转录与翻译过程几

3、乎发生在同一时间间隔内，转录与翻译偶联 真核生物：转录产物需从核内运转到核外，才能被核糖体翻译成蛋白质,一、原核基因表达调控的环节,基于调控发生的时期,原核生物中的转录和翻译水平的调控均以操纵子的方式进行,二、操纵子学说（ operon ） ,操纵子学说：原核生物基因结构及其表达调控理论，基因表达调控的基础 法国巴斯德研究所 Jacob 和 Monod 1961 年提出，在 10 年内经许多科学家的补充和修正得以逐步完善,Franois Jacob 1920 年,Jacques Monod 1910 年 1976 年,1、操纵子的提出,大肠杆菌可以利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源而

4、生长繁殖 当培养基中含有葡萄糖和乳糖时，细菌优先使用葡萄糖 当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间适应，就能利用乳糖，细菌继续呈指数式繁殖增长,法国的Jocob和Monod等人做了一系列遗传学和生化学研究实验，于1961年提出乳糖操纵子学说,2、操纵子的定义 ,操纵子：是基因表达的协调单位，由启动子、操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。 操纵基因受调节基因产物的控制。,一个操纵子 = 编码序列（2-6）+ 启动序列 + 操纵序列 + (其他调节序列),3、操纵子（operon）的基本组成,操纵子的基本结构,转录出多顺反子mRNA， 翻译后得到多种蛋白质,介导转录终止,编码功能相

5、关的蛋白质,调控区 结合RNA聚合 酶和调节蛋白,（1）启动子（promoter, P）,能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列 操纵子至少有一个启动子，一般在第一个结构基因5上游，控制整个结构基因群的转录 不同的启动子序列有所不同，但存在共有性序列(consensus sequences),不同的启动子序列不同，与RNA聚合酶的亲和力不同、启动转录的频率高低不同 不同的启动子启动基因转录的强弱不同 例如：PL、PR、PT7属强启动子，而Plac则是较弱的启动子,（2）终止子（terminator，T）,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 在一个操纵子中至少在结构基因群

6、最后一个基因的后面有一个终止子,强终止子和弱终止子 一串结构基因群中间有弱终止子的存在，则前后转录产物的量会有所不同，这也是终止子调节基因群中不同基因表达产物比例的一种方式 抗终止作用：有的蛋白因子能作用于终止序列，减弱或取消终止子的作用，称为抗终止作用（anti-termination），这种蛋白因子就称为抗终止因子（anti-terminator）,（3）结构基因,操纵子中被编码蛋白质和RNA的基因 含有2个以上的结构基因，多的可达十几个 每个结构基因是一个连续的开放读框, 5端有翻译起始码，3端有翻译终止码 各结构基因头尾衔接、串连排列，组成结构基因群,至少在第一个结构基因5侧具有SD序

7、列，当被转录成多顺反子mRNA，就能被核糖体所识别结合、并起始翻译 核糖体沿mRNA移动，在合成完第一个编码的多肽后，不脱离mRNA而继续翻译合成下一个多肽，直至合成完这条多顺反子mRNA所编码的全部多肽,（4）操纵基因 ,能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列，常与启动子邻近或与启动子序列重叠，当调控蛋白结合在操纵序列上，会影响其下游基因转录的强弱 并不编码蛋白质，起着调控基因表达强弱的作用,乳糖操纵子中的操纵基因为例 操纵基因（o）序列位于启动子（p）与被调控的基因之间，部分序列与启动子序列重叠 具有回文（palindrome）样的对称性一级结构，能形成十字形的茎环（stem loop）构

8、造 不少操纵子都具有类似的对称性序列，可能与特定蛋白质的结合相关,（5）调节基因（regulatory gene） ,编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因 与操纵序列结合后能减弱或阻止基因转录的调控蛋白称为阻遏蛋白（repressive protein），其介导的调控方式称为负调控（negative regulation） 与操纵序列结合后能增强或起动基因转录的调控蛋白称为激活蛋白（activating protein），所介导的调控方式称为正调控（positive regulation）,调节基因lac I位于Plac邻近，有其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因群的转录方向一致，编码产

9、生由347个氨基酸组成的调控蛋白R 在环境没有乳糖存在的情况下，R形成活性四聚体，能特异性与操纵子紧密结合，从而阻止利用乳糖的酶类基因的转录,当环境中有足够的乳糖时，乳糖受-半乳糖苷酶作用转变为别乳糖与R结合，使R的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类 乳糖（别乳糖）是诱导物，与R结合起到去阻遏作用，诱导了利用乳糖的酶类基因转录开放,许多调控蛋白都是变构蛋白（allosteric protein），通过与上述类似的方式与效应物结合改变空间构像，从而改变活性，起到调节基因转录表达的作用 效应物（effe

10、ctor）：某些特定的物质能与调控蛋白结合，使调控蛋白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录的影响 诱导物（inducer）：能诱导操纵子开启的效应物 辅阻遏物（corepressor）：能导致操纵子关闭，阻遏转录过程的效应物,（6）顺式作用和反式作用 ,顺式作用（cis-action）：启动子、操纵子位于紧邻结构基因群的上游，终止子在结构基因群之后，它们都在结构基因的附近，只能对同一条DNA链上的基因表达起调控作用 顺式作用元件（cis-acting element）：启动子、操纵子和终止子,反式作用（trans-action）：调节基因可以在结构基因群附近、也可以远离结构基因，它通过其基

11、因产物调控蛋白来发挥作用 调节基因不仅能对同一条DNA链上的结构基因起表达调控作用，而且能对不在一条DNA链上的结构基因起作用 反式作用元件（trans-acting element）：调节基因 反式调节因子（trans-acting factor）：其编码产生的调控蛋白,三、原核基因调控机制的类型与特点 ,1、根据操纵子对调节蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白） 的应答，可分为： 正转录调控 负转录调控,可诱导调节：某些物质的诱导下使基因活化 操纵子常常是关闭的，主要是一些编码糖和氨基酸分解代谢酶的基因，这些糖和氨基酸平时含量少，一旦生存条件发生变化，可以开启基因的表达 例：大肠杆菌的乳糖操纵子,2、

12、根据操纵子对某些能调节它们的小分子的应答，可分为可诱导调节和可阻遏调节两大类：,分解代谢酶合成的诱导操纵子模型,诱导物：与阻遏蛋白结合，改变其构型,能够促使细菌产生酶来分解它，这种物质就是诱导物。,可阻遏调节：基因常常是开启的，主要是一些合成各种细胞代谢过程中所必须的小分子物质的基因，由于这类物质在生命活动中的重要地位，操纵子呈开启状态； 由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达 例：色氨酸操纵子 合成代谢蛋白的基因,酶合成的阻遏操纵子模型,辅阻遏物,由于某物质的结合使无活性的阻遏物激活，便阻止细菌蛋白的合成，这种物质为辅阻遏物。,3. 在负转录调控系统中，调节基因的产物是

13、阻遏蛋白（repressor），阻止结构基因的转录 分为负控诱导和负控阻遏 负控诱导系统中，阻遏蛋白与诱导物结合，使结构基因转录； 负控阻遏系统中，阻遏蛋白与辅阻遏物结合时，阻止结构基因的转录,4. 在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白（activator） 正控诱导和正控阻遏 正控诱导系统中，诱导物的存在使激活蛋白活化； 正控阻遏系中，辅阻遏物的存在抑制激活蛋白的活性,负控诱导系统,负控阻遏系统,正控诱导系统,正控阻遏系统,对 比,四、弱化子对基因活性的影响,弱化子（attenuation）：当操纵子被阻遏、RNA 合成终止时，起终止转录信号作用的的一段核苷酸 调节方式：核糖体在转录

14、本上的位置, 决定了 RNA 形成的二级结构, 从而决定基因能否继续转录 调节信号分子: 细胞中某一氨基酸、嘧啶或氨酰-tRNA的浓度,五、降解物对基因活性的调节,降解物抑制作用（葡萄糖效应）：在葡萄糖存在时，细菌不利用乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等，与其相对应的操纵元也不启动，不产生相应的酶，此为葡萄糖效应或降解物抑制作用,六、细菌的应急反应,应急反应：当细菌氨基酸全面匮乏时，会产生一个应急反应，如停止合成 RNA、糖、脂肪和蛋白质相关的生物化学反应 应急反应实施信号：鸟苷四磷酸（ppGpp）和鸟苷五磷酸（pppGpp），一种超级调控因子 诱导物：空载 tRNA,第二节 乳糖操纵元与负控诱

15、导系统 lactose operon, negative induction,一、乳糖操纵元的结构及本底表达 二、乳糖操纵元的调控位点 二、乳糖操纵元的负控诱导系统 四、乳糖操纵元的正调控 五、 操纵元的突变-遗传分析验证操纵元功能 六、 lac 操纵元中的其它特点,一、乳糖操纵子的结构及本底表达,大肠杆菌乳糖操纵子包括 3 个结构基因：Z、Y 和 A ，以及启动子、操纵子和阻遏子等 转录时，RNA 聚合酶首先与启动区（Promoter, P）结合，通过操纵子（Operator, O）向右转录, 半乳糖苷酶： 半乳糖苷键的专 一 性酶，可将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，也水解其他 半乳糖苷（如苯

16、基半乳糖苷） 透过酶：使外界的 半乳糖苷（如乳糖）透过大肠杆菌细胞壁和原生质进入细胞内 用乳糖为大肠杆菌生长的惟 一 碳源和能源时，这两种酶是必需的,lac 操纵元的本底表达及特点 诱导物穿越细胞膜需要透过酶，一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成 真正的诱导物是乳糖的异构体 异构乳糖，别乳糖是在 半乳糖苷酶的催化下由乳糖产生的，需要 半乳糖苷酶的预先存在 本底水平的组成型合成（background level， constitutive synthesis）：在非诱导状态下有少量的 lac mRNA 合成,二、乳糖操纵元的调控位点,Operator 操纵基因 阻遏蛋白结合区,O区：阻遏物结合

17、区，位于P区后半部分和转录起始区（-7+28），该区序列有对称性，其对称中心点在+11位，对称序列，6bp,2. 启动启动子区 RNA聚合酶结合位点 从I基因结束到mRNA转录起始位点下游5-10bp 含cAMP-CAP结合区：cAMP结合位点 （-67-52），有对称性，其对称位点在-60-59之间,几个 操纵元 DNA 的调控区域 P、O 区 阻遏物与o区的结合影响了RNA聚合酶与启动子区结合形成转录起始复合物的效率,三、乳糖操纵元的负控诱导系统,1. 阻遏物 lac 基因产物及功能 Lac 操纵元阻遏物 mRNA：弱启动子控制 组成型表达,阻遏蛋白：由 4 个相同的亚基组成，每个亚基含有

18、 347 个氨基酸残基，并能与 1 分子 IPTG 结合,乳糖操纵元的三个操纵子序列与阻遏蛋白结合的特征及其作用,阻遏蛋白质-DNA 互作空间构像,lacZ基因内部的O2核苷酸序列作为操纵基因时（Operator），有阻遏蛋白就会与其结合，从而阻止基因表达，这是一种高效阻遏的非常保险的方式：即编码序列具有操纵基因序列，被阻遏蛋白结合，因而不可能表达转录本。 生物进化的保险机制。,阻遏蛋白结合在操纵子部位,2. 大肠杆菌对乳糖的反应,培养基中有无诱导物对 lac mRNA 及 半乳糖苷酶活性的影响,无乳糖存在， lac mRNA 及 半乳糖苷酶本底水平表达 有乳糖存在， lac mRNA诱导表达

19、， 半乳糖苷酶和透过酶合成 乳糖消耗，阻遏物持续合成，细胞重新构建阻遏状态， lac mRNA合成受抑制，总量下降 酶合成停止，但是蛋白半衰期较长，可以维持一段时间,安慰性诱导物（gratuitous inducer）：高效诱导物，但不是半乳糖苷酶的底物 乳糖类似物 异丙基巯基半乳糖苷（IPTG），巯甲基半乳糖苷（TMG），发色底物 O 硝基半乳糖苷（ONPG）都是安慰性诱导物 IPTG 应用最多, 与 X-gal 结合，细菌蓝白斑筛选,IPTG,TMG,ONPG,四、乳糖操纵元的正调控 ,1. 葡萄糖对 lac 操纵元的影响 半乳糖苷酶作用：把乳糖分解成葡萄糖及半乳糖 葡萄糖和乳糖同时加入培

20、养基：大肠杆菌在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发 lac 操纵子 葡萄糖对lac操纵子表达的抑制作用是间接的 葡萄糖的某些降解产物抑制 lac mRNA 的合成，葡萄糖的这种效应为代谢物阻遏效应（catabolite repression）,当葡萄糖和乳糖同时存在于培养基中时，lac 启动子表达受阻，没有 半乳糖苷酶活性 当葡萄糖消耗完以后（箭头处），细胞内 cAMP （环腺苷酸）浓度增加， 半乳糖苷酶活性增加，一度停止生长的细胞又恢复分裂,？,细菌的 cAMP 含量，与葡萄糖的分解代谢有关：当分解葡萄糖产生能量时，cAMP 生成少分解多，故 cAMP 浓度低 当环境中无葡萄糖供应时，cAMP 含量

21、升高，为何？ cAMP 合成由 腺苷酸环化酶 (AC) 催化，葡萄糖抑制腺苷酸环化酶的活性; 无葡萄糖，腺苷酸环化酶活性高，cAMP 高,cAMP 的糖分子的3和5同时与一个磷酸形成3-5磷酸二酯键,cAMP: adenosine 3,5-cyclic monophosphate,2. CRP（CAP）与 cAMP （环化AMP） 为何同时存在乳糖和葡萄糖时，乳糖操纵元受阻不开放？ 乳糖操纵元开放，还需一种 cAMP 的受体蛋白 （cAMP receptor protein, CRP）的正调控，也称为 代谢物激活蛋白（catabolite activating protein, CAP） CR

22、P 与 cAMP 结合并发生空间构象变化而活化，能以二聚体的方式与特定的 DNA 序列结合，从而启动 Lac 操纵元,cAMP-CRP能与DNA相结合，造成双螺旋弯曲，易于形成三元转录起始复合物 阻遏物则是抗解链蛋白，阻止形成开放结构,CRP激活转录的方式,只要有这个“环”的亚基存在，阻遏物无法与O区相结合，lac operon得到表达,CAP结合位点,CAP为二聚体， 45KD ，被cAMP激活 结合位点22bp I -70 -50 II -50 -40,CAP cAMP 在 CAP 位点上与 RNA pol 的相互作用,gal, lac 和 ara 操纵子上游启动子区与 CAP cAMP

23、结合位点的相对位置分析,CAP 的正调控作用，结合后启动 Lac 操纵元转录,lac 启动子在两个相互独立的调控体系互作下实现其功能, 乳糖操纵元正控系统和负控系统比较,五、 操纵元的突变-遗传分析验证操纵元功能,1. 显性突变：操纵子突变（O+ Oc），结构基因组成型表达,等位基因间的显隐关系 w.t. (I+ O+ P+) 诱导型 加入诱导物 操纵子开启 无诱导物 操纵子关闭 OC mut. (I+ OC P+) （组成型） OC失去与阻遏蛋白特异结合的能力 有无诱导物 操纵子均开启 组成部分二倍体OCO+ OC O+ cis-dominant,iS p o,mut repressor,I

24、+,组成部分二倍体 IS/I+ IS/iC iS I+ iS iC,等位基因间的显隐关系 w.t. (I+ O+ P+) 诱导型 加入诱导物 操纵子开启 无诱导物 操纵子关闭 iS mut. (iS O+P+) (超阻型) iS gene 产物阻遏蛋白不能与诱导物结合 有无诱导物，操纵子均关闭,2. 隐性突变：阻遏蛋白基因突变（I+ IC），结构基因组成型表达,等位基因间的显隐关系 w.t. (I+ O+ P+) 诱导型 加入诱导物 操纵子开启 无诱导物 操纵子关闭 iC mut. (iC O+P+) (组成型) iC gene产物阻遏蛋白丧失与O位点结合的能力 可诱导表达 组成部分二倍体 I

25、+/IC I+ iC,六、 lac 操纵元中的其它特点,1. A 基因及其生理功能 A基因编码 半乳糖苷乙酰基转移酶 半乳糖苷酶降解的半乳糖苷分子不能进一步代谢，不少半乳糖苷衍生物在高浓度时是细胞生长的抑制物 A 基因能把乙酰基转移到半乳糖苷分子上，但它抑制了 半乳糖苷酶产物的有害性衍生物在细胞内积累，在生物进化中具有意义,2. lac基因产物数量上的变化 在一个完全被诱导的细胞中，-半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶的拷贝数比例为1:0.5:0.2 反映了以-半乳糖苷作为唯一碳源时细胞的需要 调控机制： lac mRNA可能与翻译过程中的核糖体相脱离，从而终止蛋白质链的翻译；频率取决于每一个后

26、续的AUG密码子再度起始翻译的概率 在lac mRNA分子内部，A基因比Z基因更易受内切酶作用发生降解，在任何时候Z基因的完整拷贝数要比A基因多,Spacer 较短时,3. 操纵子的融合与基因工程 自然条件下，lac操纵子与负责嘌呤合成的pur操纵子偶联 位于lac操纵子沿转录方向的下游，中间隔一个控制细胞对T6噬菌体敏感性的tsx基因 tsxsZ+ tsxRZ-,Lac启动子转录酶有较高的亲和力，可高效启动转录的启动子，可使较弱启动子的转录增强，增加蛋白质的合成量,第三节 色氨酸操纵元与负控阻遏系统Tryptophan operon，negative repression,一、trp 操纵元

27、的阻遏系统 二、弱化子与前导肽 三、trp 操纵子弱化机制的实验依据 四、阻遏和弱化作用的协调 四、trp 操纵元的其它调控机制,细菌中色氨酸生物合成途径,trpG-D 和trpC-F基因融合 trpE和trpG编码邻氨基苯甲酸合酶 trpD编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶 trpC编码吲哚甘油磷酸合酶，trpF编码异构酶 trpA和trpB分别编码色氨酸合酶的和亚基,trpE 基因是第一个被翻译的基因，和 trpE 紧邻的是启动子区和操纵区 前导区和弱化子区分别定名为 trpL 和 trpa trpR 编码阻遏物，它距 trp 基因簇很远。后者位于大肠杆菌染色体 25 min 处，而前者在 9

28、0 min 位置 在 65 min 处有一个 trpS（色氨酸 tRNA 合成酶），它与携带色氨酸的 tRNATrp 共同参与 trp 操纵子的调控作用,大肠杆菌中的 trp 操纵元,受阻遏系统和弱化系统的调控,一、 trp 操纵元的阻遏系统,阻遏蛋白（aporepressor）：trpR 基因的产物，该基因突变常引起 trp mRNA 的组成型合成 阻遏蛋白与操纵子的结合需要色氨酸（效应物） 阻遏蛋白与色氨酸结合形成有活性的阻遏物，再与操纵区结合即关闭 trp mRNA 转录,效应物：色氨酸由 trp 操纵元编码的合成途径的末端终产物 当培养基中色氨酸供应不足时，阻遏物失去色氨酸并从操纵子上

29、解离，trp 操纵子去阻遏，可转录 当培养基中色氨酸含量较高时，它与游离的阻遏蛋白相结合，并使之与操纵子 DNA 紧密结合，抑制转录,trp 操纵元的阻遏系统,自动调控 避免浪费,二、 弱化子与前导肽,色氨酸高浓度和低浓度下，trp操纵子的表达水平相差600倍，而阻遏作用仅能使转录降低70倍 阻遏物失活突变不能完全消除色氨酸对操纵子表达的影响 阻遏-操纵机制对色氨酸来说是一个一级开关，主管转录是否启动，相当于粗调开关 其它调控机制弱化作用进行细调控，指示已经启动的转录是否继续下去 通过转录达到第一个结构基因之前的过早终止来实现的，由色氨酸的浓度来调节这种过早终止的频率,1. 弱化子 前导区：在

30、 trp mRNA 5 端 trpE 基因的起始密码前有一个长 162 bp 的 mRNA 片段，为前导区 弱化子：当 mRNA 合成起始后，有色氨酸时，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有 140 个核苷酸的 RNA 分子，终止 trp 基因转录，该区域为弱化子,茎 环结构：引起终止的 mRNA 序列自身配对形成茎 环结构，具典型的终止子特点,2. 前导肽 在Trp中，含 AUG 和 UGA ，若翻译起始于 AUG ，可产生一个 14 aa 短肽，这个假设的短肽称为前导肽。 前导肽第 10，第 11 位上有相邻的两个色氨酸密码子，UGG，UGG，参与了 trp 操纵元中的转录弱化机制,弱化子

31、结构,trpE 基因的起始密码前有一个 162 bp 的 mRNA 片段,四个区域的 可能配对方式,10, 11位的Trp,3. 转录弱化作用机理,无色氨酸，无负载色氨酸的 tRNATrp ，通过两个相邻色氨酸密码子的速度慢，当4区被转录完成时，核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp密码子处），前导区结构为 2 3 配对，无 3 4 配对，可转录 有色氨酸，核糖体很快就通过两个相邻色氨酸密码子， 2 3 不能配对， 有3 4 配对形成茎 环状终止结构，终止转录,2,3,3,4,Trp codon 在核糖体上,Trp codon 离开核糖体,trp 操纵元的转录与翻译偶联调控,转录和翻译偶

32、联，才可能发生弱化作用,如果当其他氨基酸短缺或所有的氨基酸都不足时，核糖体翻译移动的速度就更慢，甚至不能占据A的序列，结果有利于A和C发夹结构的形成，于是RNA聚合酶停止转录 等于告诉细菌：“整个氨基酸都不足，即使合成色氨酸也不能合成蛋白质，不如不合成以节省能量” 细菌其他氨基酸合成系统的许多操纵子（如组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等操纵子）中也有类似的弱化子存在,原核 RNA 前导序列的变构引起转录继续,区没有配对的发夹结构,原核 RNA前导序列的变构引起转录的终止或弱化,三、 trp 操纵子弱化机制的实验依据,在色氨酸浓度高时，色氨酰 tRNA 合成酶缺陷型的 trp 操纵元表

33、达 温度敏感突变株 trpS5 的 Trp tRNA 合成酶只在 30 0C 时有活性，在 42 0C 时无活性 30 0C 时，色氨酰 tRNA合成酶有活性，可生成 tRNATrp，trp 操纵元不表达 42 0C 时，色氨酰 tRNA 合成酶失去活性，不能生成 tRNATrp，trp 操纵元表达,另有一个缺失前导区及D基因的突变体（trpLD102），该细菌在有色氨酸的培养基中仍有很高的色氨酸合成酶活性,有实验证明，在不加色氨酸的培养基中，trp mRNA的合成仍然受到部分阻遏 现在一般认为，野生型细胞中同时存在着有活性和无活性的阻遏物，培养基中色氨酸浓度的变化，能够使这两种阻遏物间的平衡

34、发生倾斜，最终做出关闭或启动trp操纵子的决定，从而维持一定的色氨酸含量,四、阻遏与弱化作用的协调,一种可能是阻遏物从有活性向无活性的转变速度极低，需要有一个能更快地做出反应的系统，以保持培养基中适当的色氨酸水平 弱化子系统主要是对外源色氨酸浓度做出反应。外源色氨酸浓度很低的信号虽然足以引起trp操纵子的去阻遏作用，但是这个信号还不足以很快引发内源色氨酸的合成 在这种环境下，弱化子就通过抗终止的方法来增加trp基因表达，从而提高内源色氨酸浓度,1. 细菌中为什么要有弱化子系统呢？,2. 为什么还要有阻遏体系呢？,没有阻遏体系，只有弱化也可以调节色氨酸酶系的合成 阻遏的作用是在有大量外源色氨酸存

35、在时，保障阻止非必需的先导 mRNA 的合成，不合成色氨酸转录本，生物的合成系统更加经济，避免浪费 组氨酸操纵子拥有在功能上与 trp 操纵子完全相同的弱化子结构，但没有阻遏物，它的表达完全受弱化子调节,五、 trp 操纵元的其它调控机制, 大肠杆菌（E. coli）： 共有 5 个基因参与色氨酸生物合成，构成色氨酸操纵元 trpG D 和 trpC F 为融合基因，翻译出的多肽具有双重功能 有两个启动子控制整个操纵子的转录，能够感受色氨酸和无负载的 tRNATrp 的浓度变化 枯草芽孢菌（Bacillus subtilis）： 色氨酸操纵子包括 6 个基因，处于一个 12 个基因的大操纵子内

36、 B. subtilis 还有第 7 个色氨酸合成基因 trpG（又称 pabA），位于叶酸操纵子中 翻译出来的 Trp-PabA 多肽链能发挥两个酶的作用，一个用于色氨酸途径，一个用于叶酸途径,B. subtilis（枯草芽胞杆菌）中色氨酸操纵元的调控机制,色氨酸激活调节蛋白TRAP，形成终止子结构 无负载的tRNATrp聚集使TRAP失活，激活转录和翻译 无负载的tRNATrp浓度升高，rtpA基因编码的AT蛋白与TRAP结合，激活转录,第四节 其它操纵元,一、半乳糖操纵元 二、阿拉伯糖操纵元 三、阻遏蛋白Lex的降解与细菌中的SOS应答 四、多启动子调控的操纵子,一、半乳糖操纵元 大肠杆

37、菌半乳糖操纵子（galactose operon）在大肠杆菌遗传图上位于 17 min 处 包括 3 个结构基因：异构酶（UDP galactose 4 epimerase, galE），半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶（galactose transferase, galT），半乳糖激酶（galactose kinase, galK） 3 个酶的作用：使半乳糖变成葡糖 1 磷酸 调节基因是galR与galE、T、K及操纵区O等离得很远，而galR产物对galO的作用与lacI-lacO的作用相同, gal操纵元的结构及其代谢途径,（a）操纵元的结构,（b）代谢途径, 半乳糖操纵元的结构及其调控机

38、制,1. cAMP CRP 对 gal 启动子的作用,gal 操纵子 P O 区序列中有两个相距仅为 5 bp 的启动子 每个启动子拥有各自的 RNA 聚合酶结合位点 S1 和 S2 gal 操纵子可以从两个启动子分别起始基因转录,cAMP-CRP对从S1和S2 起始的转录有不同作用 无葡萄糖时， cAMP-CRP浓度高，从S1起始的转录顺利进行，RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖 有葡萄糖时，无cAMP-CRP，转录从S2开始,半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质-尿苷二磷酸半乳糖（UDP-gal）是大肠杆菌细胞壁合成的前体，生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构

39、酶，保证尿苷二磷酸的供应 在没有外源半乳糖的情况下，UDP-gal是通过半乳糖差向异构酶（ galE基因的产物）的作用由UDP-葡萄合糖成的,2. 双启动子的生理功能,假如只有S1启动子，由于这个启动子的活性依赖于cAMP-CRP，当培养基中有葡萄糖存在时就有不能合成异构酶galE； 假如只有S2启动子，那么在葡萄糖存在的情况下，半乳糖使操纵子处于充分诱导状态，这无疑是一种浪费 从必要性或经济性考虑，都需要一个不依赖于cAMP-CRP的启动子（S2）进行本底水平的组成性合成，以及一个依赖于cAMP-CRP的启动子（S1）对高水平合成进行调节,二、阿拉伯糖操纵元,阿拉伯糖（arabinose）是

40、另一个可以为代谢提供碳源的五碳糖 在大肠杆菌中阿拉伯糖的降解需要3个基因：araB、araA和araD 分别编码3个酶：araB基因编码核酮糖激酶，araA编码L-阿拉伯糖异构酶，araD编码L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶,1. ara 操纵元的特点,双向转录：araPBAD 和araPc转录方向相反 AraC有3个结合位点（O1，O2，araI：激活蛋白结合位点） Pc和O1重叠 AraC既可充当阻遏物，也可作为激活剂。纯的AraC 结合araO1，阻遏作用；C+Ara 结合于araI调节区，诱导，正调节。 araC本身受到操纵调节（自身调节） araC的表达受自身产物AraC的调控：

41、当没有阿拉伯糖时，AraC起着一个转录阻遏物的作用。 阻遏araC转录大约需要40个AraC。因此当AraC蛋白水平低时，araC将表达直至存在足够的AraC去阻遏它的转录。,2. AraC 蛋白的正、负调节作用,有Ara无Glu时，AraC 蛋白与诱导物阿拉伯糖相结合后，结合于araI，诱导 araPBAD 转录 正控系统中，起始转录还需要 cAMP CRP 参与,当Glu较高， Ara水平较低时， AraC过量，可结合到araO1，阻遏Pc。 AraC 蛋白与操纵区O2以及araI诱导因子结合区上半区相结合，形成DNA回转结构，araBAD 基因不表达,AraC蛋白作为PBAD活性正、负调

42、节因子的双重功能是通过该蛋白的两种异构体来实现的 Pr是起阻遏作用的形式，可以与现在尚未鉴定的类操纵区位点相结合， Pi是起诱导作用的形式，它通过与PBAD启动子结合进行调节 没有阿拉伯糖时，Pr形式占优势；有阿拉伯糖存在，它就能够与AraC蛋白结合，使平衡趋向于Pi形式 阿拉伯糖的诱导作用就可以解释为阿拉伯糖与Pr的结合，使Pr离开它的结合位点，然后，产生大量的Pi，并与启动子结合,培养基中含有葡萄糖，cAMP-CRP没有与操纵区位点相结合，AraC蛋白处于Pr形式并与O1位点结合，RNA聚合酶很少再与Pc结合，araC基因虽然仍有转录，但受到抑制，只有少量 AraC蛋白形成，整个系统几乎处

43、于静止状态,3. 营养状况对ara操纵子活性的影响,没有葡萄糖，也没有阿拉伯糖，因为没有诱导物，尽管有cAMP-CRP与操纵区位点相结合，AraC蛋白仍以Pr形式为主，无法与操纵区O2位点相结合，无araBAD mRNA转录,无葡萄糖，阿拉伯糖时，大量araC基因产物以Pi形式存在，并分别与操纵区O1、O2位点相结合，在cAMP-CRP的共同作用下，araC和araBAD基因大量表达，操纵子充分激活,三、阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答,SOS系统基因LexA 编码阻遏蛋白 RecA低水平表达 RecA 与DNA单链结合活化成为蛋白酶 切割LexA 阻遏蛋白 SOS系统高效表达，DN

44、A修复,四、多启动子调控的操纵子（P276）,1rRNA操纵子 大肠杆菌rRNA操纵子（rrnE）上有两个启动子，P1和P2 P1是强启动子，营养充沛时，由P1起始的转录产物比由P2起始的转录产物高3-5倍 当营养匮乏时，P1的作用被抑制，但P2仍有功能,2. 核糖体蛋白SI操纵子 核糖体蛋白SI操纵子（rpsA），它也受应急反应调节 RpsA有4个启动子，P1、P2是强启动子，平时主要依靠它们来启动基因的表达，合成SI蛋白 P3、P4是弱启动子，只有在紧急情况下，P1、P2启动子受ppGpp的抑制，由P3、P4起始合成的SI蛋白维持了生命的最低需要,3. Dna Q蛋白操纵子,Dna Q蛋白

45、是DNA聚合酶全酶的亚基之一，其主要功能是校正DNA复制中可能出现的错误 受RNA聚合酶活性的调节，有两个启动子 在RNA聚合酶活性较低时，操纵子的转录由弱启动子P2控制；而RNA聚合酶活性较高时，就开始利用强启动子P1,第五节 转录水平的其他调控方式（P282）,一、因子的活性调节及选择性使用 二、组蛋白类似蛋白的调节作用（略） 三、转录调控因子的作用（略） 四、抗终止因子的调节作用（略）,E. coli 中基因表达调控最常见的蛋白质是因子， 70 是调控基本生理功能如碳代谢、生物合成等基因转录所必须的因子,一. 因子的活性调节及选择性使用（P248）,70 家族：除54 外，其它 5 种因

46、子在结构上具有同源性，统称70 家族 大肠杆菌的因子（以70 为例）主要包括 4 个结构域：其中第 2 个和第 4 个保守区参与结合启动区 DNA，第 2 个保守区的另一部分还参与双链 DNA 解开成单链的过程,70 类启动子：核心酶结合到 DNA 链上后与启动子区相结合 54 启动子：类似于真核生物的 TATA 区结合蛋白（TBP），在无核心酶时可独立结合到启动子上, 70 和54 因子识别并结合在所调控基因上游的不同区域,70 类启动子,54 启动子,因子的选择性使用与热激基因的表达调控 高温下， 32因子数量增加，替代70因子，引导RNA聚合酶到热休克基因的启动子上，激活热休克基因的转录,ropS,因子的级联与噬菌体不同时期基因表达之间的关系 由一种起始因子启动第二种因子及其附带基因，依次类推,SP