生物化学与分子生物学：第14章 DNA的生物合成

1、中心法则 (central dogma) 遗传信息从DNA到RNA，再到蛋白质的传递规律。,1958 F.Crick 遗传中心法则 1970 H.Temin 逆转录,基因：编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的、负载遗传信息的基本单位。,名词解释：基因 (gene)；基因组 (genome),基因组：细胞或生物体的一套完整单倍体遗传物质的总和。,What exactly is a Gene?,第14章,DNA的生物合成 DNA Biosynthesis,Questions 生物如何保持其遗传的稳定性？ 真核生物和原核生物的DNA复制是如何进行的？有什么区别？ 逆转录是如何发生的？,亲代DNA,

2、子代DNA,复制 (replication) 是指遗传物质的传代，以亲代DNA为模板合成子代DNA的过程。,C,G,A,书写方法：,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,DNA双螺旋结构,本章主要内容,第一节 DNA复制的基本特征 第二节 DNA复制的酶学和拓扑学变化 第三节 原核生物DNA复制过程 第四节 真核生物DNA生物合成过程 第五节 逆转录和其他复制方式,DNA复制的基本特征 Basic Rules of DNA Replication,第 一 节,掌握：DNA复制的主要特征；半保留复制、半不连续复制和冈崎片段的概念 熟悉：DNA半保留复制的实验证据

3、 了解：复制子,本节教学大纲,DNA复制的主要特征,半保留复制 (semi-conservative replication) 双向复制 (bidirectional replication) 半不连续复制 (semi-discontinuous replication),半保留复制的概念:,一、DNA以半保留方式进行复制,DNA复制时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA双链，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。这种复制方式称为半保留复制。,DNA复制方式的3种可能性,全保留式 半保留式 混合式,亲代DNA,子代DN

4、A,M. Meselson,F. W. Stahl,15N标记DNA实验 (细菌能够以NH4Cl为氮源合成DNA),15N标记DNA实验证明半保留复制假设,含15N-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,15N-DNA,问 题 1、证实DNA合成是半保留复制的是 AM. Meselson & F. W. Stahl BWatson & Crick COkazaki & Cech DKorn & Temin 2、DNA以半保留复制方式进行复制，1个完全被同位素（放射性核素）标记的DNA分子置于无放射性标记的溶液中复制两代，其放射性状况如何 A4个分子的DNA均有放射性 B4个分子的DNA均

5、无放射性 C2个分子的DNA有放射性 D4个分子的DNA双链中仅有一条链有放射性,DNA的半保留复制,亲代DNA 母链DNA Parent strand,子代DNA 子链DNA Daughter strand,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,C C A C T G G,G G T G A C C,A G G T A C T G,T C C A T G A C,T C C A T G A C,A G G T A C T G,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A

6、 C G G T G A C C,A G G T A C T G C C A C T G G,T C C A T G A C G G T G A C C,+,亲代DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,DNA半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,二、DNA复制从起点向两个方向延伸,原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制。,A. 环状双链DNA及复制起始点 (origin, ori)

7、 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点 (termination, ter),真核生物每个染色体有多个起始点，习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。真核生物是多复制子的复制。 复制子是独立完成复制的功能单位。,三、DNA复制反应呈半不连续特征,前导链 (leading strand),后随链 (lagging strand),DNA的一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复制。,在DNA复制中，复制方向与解链方向一致，因而能沿5至3方向连续延长的子链称为前导链(leading strand)，又称领头链。 在DNA复制中，复制方向与解链方向相反，不

8、能沿着解链方向连续延长的子链称为后随链(lagging strand)，又称随从链、滞后链。,在DNA复制中，前导链连续复制而后随链不连续复制的方式称为半不连续复制。 在DNA复制中，不连续的复制片段称冈崎片段(Okazaki fragment)。,小 结,DNA复制的主要特征：,1. 半保留复制 2. 双向复制 3. 半不连续复制,半保留复制：,半不连续复制:,在DNA复制中，前导链连续复制而后随链不连续复制的方式称为半不连续复制。,DNA复制时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA双链，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重

9、新合成。这种复制方式称为半保留复制。,前导链：,后随链：,在DNA复制中，复制方向与解链方向相反，不能沿着解链方向连续延长的子链称为后随链。,在DNA复制中，复制方向与解链方向一致，因而能沿5至3方向连续延长的子链称为前导链。,冈崎片段:,在DNA复制中，不连续的复制片段称冈崎片段。,DNA复制的酶学和拓扑学变化,第 二 节,The Enzymology and Topology of DNA Replication,掌握：复制反应体系的组成成分及各成分的作用 熟悉：DNA拓扑异构酶在复制中如何起作用 了解：DNA聚合酶、DNA解螺旋酶、DNA连接酶、引物酶、单链DNA结合蛋白,本节教学大纲,

10、参与DNA复制的物质:,底物 (substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP (dNTP) 聚合酶 (polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA pol 模板 (template): 解开成单链的DNA母链 引物 (primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子,DNA复制的基本化学反应: 脱氧核苷酸和脱氧核苷酸之间生成磷酸二酯键,(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi,RNA引物,RNA引物,子代DNA,DNA复制时聚合反应的特点:,DNA 新链生成需RNA引物和模板； 新链的延长只可沿5

11、3方向进行。,一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合,活性：,1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性,全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA pol,3 5外切酶活性:,5 3外切酶活性:,?,能切除突变的DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性:,（一）原核生物有3种DNA聚合酶,DNA pol DNA pol DNA pol ,原核生物的DNA聚合酶,DNA pol 全酶结构,DNA pol 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶，聚合反应活性远高于DNA pol。,全酶(10个亚基)结构包括：

12、 2个核心酶 (、和)； 1个-复合物 (、 6种亚基)； 1对-亚基 (可滑动的DNA夹子)。,亚基（130 000）主要功能是合成DNA 亚基具有35外切酶活性（复制保真性所必需）亚基可增强其活性 亚基可能起组装作用,核心酶由、和亚基组成：,两侧的亚基的作用: 夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动。,2个-亚基分别和1个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链。,功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用,-复合物由6种亚基组成：、,功能：,DNA pol （109kD）,对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出

13、现的空隙进行填补。,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA pol ,木瓜蛋白酶,DNA pol （120kD）,DNA pol II基因发生突变，细菌依然能存活。 DNA pol 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。,（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有5种,DNA pol 起始引发，有引物酶活性。 DNA pol 参与低保真度的复制。

14、DNA pol 在线粒体DNA复制中起催化作用。 DNA pol 延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。 DNA pol 在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,真核生物的DNA聚合酶,真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较,课本p285表格错误,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：,二、DNA pol的碱基选择和校对功能实现复制的保真性,遵守严格的碱基配对规律； DNA pol在复制延长时对碱基的选择功能； 复制出错时DNA pol的及时校读功能。,（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择,DNA pol对碱基有选择能力，能选择与亲代模板链正确配对的碱基进入子链相应的位置。,利用“错配”实验发现

15、，DNA pol 对核苷酸的掺入(incorporation)具有选择功能。 DNA pol 对嘌呤的不同构型表现不同亲和力，因此实现其选择功能。,（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正,核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。,A：DNA pol 的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA pol 不表现外切酶活性。,DNA pol 的校读功能,三、复制中的解链伴有DNA分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,

16、（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态,E. Coli 基因图 (约34.7Mb),解螺旋酶 (helicase) 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。(视频1：解螺旋酶) 单链DNA结合蛋白 (single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。 引物酶 (primase) 复制起始时催化生成RNA引物的酶。,引 物 酶,引物为一段短的RNA片段 引物酶：催化引物的生成 为什么需要引物？ DNA聚合酶不能催化游离的dNTP聚合短链RNA为DNA生物合成提供了3-OH末端,（二）DNA拓扑异构

17、酶改变DNA超螺旋状态,复制过程正超螺旋的形成：,解链过程中正超螺旋的形成,既能水解 、又能连接磷酸二酯键。,拓扑异构酶 拓扑异构酶,拓扑异构酶分类：,拓扑异构酶作用特点：,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。,拓扑异构酶作用机制：,视频2：解链过程中超螺旋的形成和拓扑异构酶作用,四、DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，

18、从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶 (DNA ligase) 作用方式：,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,DNA连接酶的催化作用：,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 是基因工程的重要工具酶之一。,DNA连接酶功能：,DNA聚合酶、拓扑酶和连接酶 催化磷酸二酯键生成的比较,小 结,底物 (substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶 (polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA pol； 模板 (template): 解开成

19、单链的DNA母链； 引物 (primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合； 其他的酶和蛋白质因子。,复制反应体系的组成成分及各成分的作用,原核生物DNA复制过程 The Process of DNA Replication in Prokaryotes,第 三 节,熟悉：原核生物DNA复制的基本过程 了解：引发体的形成,本节教学大纲,生物体在细胞分裂之前要完成DNA复制。DNA复制是一个连续酶促反应的复杂过程，大致分为复制的起始、延伸及终止三个阶段。,一、复制的起始,需要解决两个问题： DNA解开成单链，提供模板。 形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。,起始是复制中较为复杂的环

20、节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成RNA引物。,复制起始点,第82等分位点,E. Coli 基因组结构,E.coli复制起始点 oriC,（一） DNA的解链,原核生物的复制起始部位及解链,视频3：DNA解成单链,（一） DNA的解链,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,SSB,（二）引物合成和引发体形成,引发体和复制叉的生成,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,含有解螺旋酶(DnaB蛋白)、DnaC蛋白、引物酶

21、和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,视频4：引发体的生成,二、DNA链的延长,复制的延长指在DNA pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,OH 3,3,领头链沿着53方向可以连续地延长。,领头链(前导链)的合成,随从链(后随链)的合成,在复制叉同时合成前导链和后随链,同一复制叉上前导链和后随链由相同的DNA pol催化延长,复制过程简图,视频5：复制的延长,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,三、复制的终止,复制起始点,复制终止点,第82等分位点,第32等分位点,E. Coli

22、基因组结构,在复制的终止阶段，要切除引物，并填补引物切除后留下的空隙。 对于E. coli DNA的复制，填补空隙主要由DNA pol 发挥这一作用。最后，由DNA连接酶将不连续的片段进行连接，从而成为完整的DNA分子。,子链中的RNA引物被取代,视频6：复制的终止,小 结,原核生物DNA复制的基本过程,起始 延长 终止,视频3：DNA解成单链,视频6：复制的终止,视频5：复制的延长,视频4：引发体的生成,真核生物DNA生物合成过程 The Process of DNA Biosynthesis in eukaryotes,第 四 节,熟悉：真核生物DNA复制的特点、端粒DNA的合成 了解：端

23、粒酶的概念,本节教学大纲,真核生物DNA复制比原核生物的复制过程复杂得多，DNA复制在细胞的S期完成； 真核生物复制子多、引物和冈崎片段短、复制叉前进速度慢； 真核生物DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶/转换； 真核生物的DNA复制与核小体装配同步进行； 真核生物的DNA末端有端粒结构，由端粒酶催化形成。,真核生物DNA复制的特点：,真核生物的细胞周期：能持续分裂的真核细胞，从一次有丝分裂结束，再到下一次分裂结束的循环过程。,G1: first gap DNA合成前期 S: synthesis DNA合成期 G2: second gap DNA合成后期 M: mitosis 有丝分裂

24、期,原核生物与真核生物的复制区别,原核 真核 DNA-pol种类 3 5 复制起始点 1 多 引物 长 短 冈崎片段 长 短 端粒加工 不需 需,一、真核生物复制的起始与原核生物基本相似,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 复制的起始需要DNA pol (引物酶活性)和pol (解螺旋酶活性)参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。,增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.co

25、li DNA pol 的亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC(复制因子C)的作用下PCNA结合于引物-模板链；并且PCNA使pol 获得持续合成能力。 PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。,二、真核生物复制的延长发生DNA聚合酶/转换,DNA pol 和pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA pol 通过PCNA的协同作用，逐步取代pol ，在RNA引物的3-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由pol 催化合成。然后由PCNA协同，pol 置换pol ，继续合成DNA子链。 发生DNA聚合酶/转换的原因是Pol 不具备持续合

26、成能力。,真核DNA聚合酶转换和后随链合成,三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体,3,5,5,3,前导链,3,5,3,5,亲代DNA,后随链,引物,核小体,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 连接酶完成复制中冈崎片段的连接、复制子之间的连接。 染色体两端DNA子链上5端去除RNA引物后，留下空隙。,四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题,切除引物的两种机制,线性DNA复制的末端,前导链产生完整的子染色单体。 后随链3端留下缩短的未复制的ssDNA区。,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,端粒的功能：,维持染色体的稳定性 维持DNA复制的完整性,端粒(telome

27、re) 指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。,视频7：端粒、端粒酶,端粒的结构特点：,末端DNA序列是多次重复的富含T、G碱基的短序列。,TTTTGGGGTTTTGGGG,人的端粒重复序列为5-(TnGn)x-3。 这些重复序列多为双链，但每个染色体的3端比5端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构可解决染色体末端复制问题。,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶(human telomerase rever

28、se transcriptase, hTRT),组成：,端粒酶(telomerase)是一种核糖核蛋白(RNP)，由RNA和蛋白质组成。 端粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体的3端ssDNA(后随链模板)为引物，将端粒序列添加于染色体的3端。这些新合成的DNA为单链。,端粒酶催化作用的爬行模型（inchworm model）,Inchworm 尺蠖 (ch hu)，尺蛾的幼虫。 属于无脊椎动物，昆虫纲，鳞翅目，尺蛾科昆虫幼虫统称。尺蠖身体细长，行动时一屈一伸像个拱桥，休息时，身体能斜向伸直如枝状。完全变态。成虫翅大，体细长有短毛，触角丝状或羽状，称为“尺蛾”。,功能：将端粒的GC-丰富区

29、的重复序列加到DNA分子的 3末端上,真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞周期的S期，而且只能复制一次。,五、真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制一次,前复制复合物在G1期形成而在S期被激活,复制基因(replicator)是指DNA复制起始所必需的全部DNA序列。 真核细胞DNA复制的起始分两步进行，即复制基因的选择和复制起点的激活。,复制基因的选择出现于G1期，基因组的每个复制基因位点均组装前复制复合物(pre-replicative complex，pre-RC)。 复制起点的激活出现于细胞进入S期以后，这一阶段将激活pre-RC，募集若干复制基因结合蛋白和DNA聚合酶，并起始

30、DNA解旋。,在原核细胞中，复制基因的识别与DNA解旋、募集DNA聚合酶偶联进行。而在真核细胞中，这两个阶段相分离可以确保每个染色体在每个细胞周期中仅复制一次。,ORC至少募集两种解旋酶加载蛋白Cdc6和Cdt1。,复制起点识别复合物（originrecognition complex，ORC）识别并结合复制基因。,三种蛋白质一起募集真核细胞解旋酶Mcm2-7。,前复制复合物(pre-RC)的形成,pre-RC磷酸化导致在复制起点组装其它复制因子并起始复制，复制因子包括3种DNA聚合酶。 DNA聚合酶在复制起点按一定顺序组装：首先Pol 和Pol 结合，然后是Pol /引发酶。,在S期，pre

31、-RC被蛋白激酶(Ddk和Cdk)磷酸化，从而被激活。,pre-RC的激活和组装真核DNA复制叉,细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。 相关的激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白(cyclin)，和催化亚基即细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin dependent kinase，CDK)。,（1）激活pre-RC，以起始DNA复制； （2）抑制形成新的pre-RC。,CDK控制pre-RC的形成和激活,真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，C

32、DK)严格控制pre-RC的形成和激活。,Cdk功能：,哺乳类动物的周期蛋白和CDK（细胞周期蛋白依赖激酶）,哺乳类动物细胞内还发现天然抑制CDK的蛋白质，例如锚蛋白(ankyrin)是CDK4的特异性抑制物，P21蛋白能抑制多种CDK。锚蛋白和P21蛋白的抑制/活化可使细胞周期开放/关闭，因此被形容为细胞周期的检查点(check point)蛋白。,在每个细胞周期过程中，仅有一次机会形成pre-RC，也仅有一次机会激活pre-RC。 pre-RC在被激活后即解体，所暴露的复制基因可形成新的pre-RC并迅速结合ORC。但在S、G2和M期，高活性的Cdk抑制pre-RC的其它组分结合ORC。只

33、有当染色体分离和细胞分裂完成时，Cdk的活性消失，新的pre-RC才能形成。,逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription & Other DNA Replication Ways,第五节,掌握：逆转录的概念 了解：逆转录酶的作用特点，逆转录是RNA病毒的复制形式,本节教学大纲,双链DNA是大多数生物的遗传物质。某些病毒的遗传物质是RNA。少数低等生物如M13噬菌体，它的感染型只含单链DNA。原核生物的质粒，真核生物的线粒体DNA，都是染色体外存在的DNA。这些非染色体基因组，采用特殊的方式进行复制。,逆转录酶 (reverse transcriptase),逆转录 (re

34、verse transcription),一、逆转录病毒的基因组RNA以逆转录机制复制,逆转录 (reverse transcription),逆转录：以RNA为模板合成DNA的过程。 特点： 1见于RNA病毒； 2需要逆转录酶 (依赖RNA的DNA聚合酶) 和RNA模板； 3产物为互补DNA (cDNA)。,逆转录酶,RNA,DNA,逆转录酶：以RNA为模板合成DNA的酶。,逆转录病毒细胞内的逆转录反应过程:,大多数逆转录病毒有致癌作用，因而将其称之为RNA肿瘤病毒。RNA肿瘤病毒对动物的致瘤作用非常广泛，可诱发白血病、肉瘤、淋巴瘤和乳腺瘤等。,人类免疫缺陷病毒(human immunode

35、ficiency virus, HIV)，可引起艾滋病。,人类免疫缺陷病毒 (Human Immunodeficiency Virus，HIV)，是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒，属逆转录病毒的一种。该病毒破坏人体的免疫能力，使免疫系统失去抵抗力，从而导致各种疾病及癌症，发展到最后，导致艾滋病 (获得性免疫缺陷综合征，Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)。,RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。 在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组(recombination)