细菌性食物中毒的快速检验【中毒相关】

1、细菌性食物中毒的快速检验,平山县疾控中心,1,毒相关,定义,食源性疾病 世界卫生组织将食源性疾病定义为“凡是通过摄食而进入人体的病原体，使人体患感染性或中毒性疾病，统称为食源性疾病”,2,毒相关,定义,食物中毒 食物中毒是指人摄人了含有生物性、化学性有毒有害物质后或把有毒有害物质当作食物摄入后所出现的而非传染性的急性或亚急性疾病，属于食源性疾病的范畴。食物中毒既不包括因暴饮暴食而引起的急性胃肠炎、食源性肠道传染病(如伤寒)和寄生虫病(如囊虫病)，也不包括因一次大量或者长期少量摄入某些有毒有害物质而引起的以慢性毒性为主要特征(如致畸、致癌、致突变)的疾病。,3,毒相关,食物中毒诊断标准主要以流行

2、病学调查资料及病人的潜伏期和中毒的特有表现为依据，实验室诊断是为了确定中毒的病因而进行的。 食物中毒诊断标准及技术处理总则 GB14938-1994,4,毒相关,中毒特征,5,毒相关,细菌性食物中毒检验,采集样品 检验程序 直接涂片、染色、镜检活菌数测定选择适当的增菌和鉴别培养基进行分离培养生化鉴定血清学鉴定毒素测定。,6,毒相关,酶联荧光免疫分析法,此E.coli O157:H7的抗原鉴别是基于在VIDAS仪器内进行的酶联荧光免疫分析。像吸液管的装置是固相容器（SPR），在分析中既作为固相也作为吸液器。SPR包被有高特异的单克隆抗体混合物。将一定量的增菌肉汤加入试剂条，肉汤中的混合物在特定时

3、间内循环于SPR内外。如果有E.coli O157:H7抗原存在则与包被在SPR内的单克隆抗体结合，其他没有结合上的化合物被冲洗掉。结合有碱性磷酸酶的抗体在SPR内外循环与结合在SPR内壁上的E.coli O157:H7抗原结合，最后的冲洗步骤将没有结合的接合剂冲洗掉。底物4-甲基伞形磷酸酮被SPR壁上的酶转换成荧光产物4-甲基伞形酮。荧光强度由光学扫描器测定。实验结果由计算机自动分析，产生基于荧光测试的试验值与标准相比较后打印出每一个被测样品的阳性或阴性结果报告。,7,毒相关,分子生物学检验技术,聚合酶链反应 聚合酶链反应是在体外酶促扩增特定DNA或RNA片段的技术 由变性Template

4、denaturation 退火Primer annealing 延伸Primer extension 三个基本步骤构成,8,毒相关,体系组成,一段长的双链DNA，是待扩增的目的片段，作为扩增反应的原始模板(template) 两段单链寡核苷酸，其序列与待扩增片段的两端相同，作为反应的引物(primer) 有四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）作为合成DNA的原料 有DNA聚合酶(polymerase)，催化DNA的合成 有合适的盐、缓冲液以及温度循环参数，以提供酶促反应的最佳条件并保证反应的产量。,9,毒相关,10,毒相关,11,毒相关,12,毒相关,13,毒相关,14,毒相关,15,毒相关,在P

5、CR体系中，相对于模板DNA，引物大量过剩，模板变性后退火时，它们以3末端相对分别结合于模板DNA 的两条互补链上，在DNA聚合酶催化下，合成新的、引物对之间的DNA片段。在第一个循环中，以两条互补的DNA为模板，从引物3端开始延伸，其5端是固定的，3端则没有固定的止点，随延伸时间的增加而增长，因此该循环的产物长度是不定的；,16,毒相关,二、PCR技术的特点,高特异性：PCR反应的特异性决定因素为：以碱基配对原则使引物与模板DNA特异正确的结合；DNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性,17,毒相关,高灵敏度：PCR产物量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12)量级的起始

6、待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在细菌的检测中，最小检出率为3个细菌；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个PFU(空斑形成单位)。,18,毒相关,PCR反应五要素的优化,1、多聚核苷酸引物 2、Taq DNA聚合酶 3、dNTP（三磷酸脱氧核苷酸） 4、模板核酸 5、缓冲液,19,毒相关,其它因素对PCR的影响,1、PCR反应的总体积 2、PCR反应的促进剂 通过加入某些物质稳定酶活性或有利于DNA的变性与复性，以提高扩增效率和反应的特异性 。,20,毒相关,稳定酶活性的有牛血清白蛋白、0.01%明胶、0.050.1% Tween-20及5mmo

7、l/L 二巯基苏糖醇（DTT），但应注意使用浓度不应过高，只有牛血清白蛋白的浓度可高达800g/ml，而对酶活性仍无抑制。 510%的二甲基亚砜有利于DNA变性，510%的甘油有利于DNA复性。,21,毒相关,注意事项,减少非特异性扩增及交叉污染 将反应管及各试剂置于冰上，以防引物与模板的非特异性结合后产生扩增； 注意使用防止产生气溶胶的加样头，以避免交叉污染； 最好先加入反应所需无菌水，再依次加入各成分，最后加入聚合酶及模板。,22,毒相关,PCR产物的检测分析,凝胶电泳： 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳区分小于300b的DNA片段,23,毒相关,24,毒相关,电泳缓冲液：,常用的电泳缓

8、冲液有三种，即Tris-硼酸(TBE Tris-boric acid-EDTA)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE) EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物被降解,25,毒相关,样品缓冲液,便于观察溴酚兰在碱性溶液中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，其迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段相似；二甲苯腈在该溶液中呈兰色，其在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA相近 减少扩散蔗糖或甘油使样品的比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内，减少扩散,2

9、6,毒相关,核酸染色剂,溴化乙锭染色：溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出橘黄色荧光。EB贮备液浓度为10mg/ml水溶液，应放冰箱避光保存；常用终浓度为0.5g/ml，可根据情况在制胶时加入，或者在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1015min。染色后若肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng，当溴化乙锭太多，凝胶本底会染色过深，不易看清弱显色带时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。由于溴化乙锭是一种诱变剂，使用时应戴手套，并避免环境污染。,27,毒相关,银染色：银染色液中的银离子(Ag+)可与

10、核酸形成稳定的复合物，然后用甲醛等还原剂使Ag+还原成银颗粒，使核酸带呈黑褐色，主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色，其灵敏度比EB高，但缺点是银染色后，DNA不宜回收再使用。,28,毒相关,PCR污染与对策,污染原因 （1）PCR扩增产物污染 最主要最常见的污染问题 （2）标本间交叉污染主要由于盛装标本的容器被污染 、加样枪污染导致标本间污染 、有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶扩散，导致彼此间的污染,29,毒相关,防止污染的方法 （1）合理分隔实验室 （2）分装PCR试剂 （3）防加样枪引起污染 （4）选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离

11、心管时动作要轻，以防管内液体溅出。,30,毒相关,原则上分为四个分隔开的工作区域： 试剂贮存和准备区； 标本制备区； 扩增反应混合物配制和扩增区； 扩增产物分析区。,31,毒相关,PCR分类,对称引物系统PCR 1、经典PCR 2、巢式PCR 3、多重PCR 4、膜结合PCR 5、原位PCR,32,毒相关,不对称PCR,将反应系统中由于引物浓度的巨大差别，导致扩增的产物以某条单链DNA为主的PCR称为不对称PCR。两条引物的浓度相差很大（50100：1），浓度低的称为限制性引物，浓度高的称为非限制性引物，在最初的十几个循环中，两条DNA的目的片段得到等量扩增，但后来限制性引物被消耗殆尽，只有非

12、限制性引物尚存，扩增的产物主要为该引物引导的单链DNA。不对称PCR主要为序列测定制备单链DNA,33,毒相关,逆转录PCR,以RNA为模板的PCR称为逆转录PCR（Reverse Transcriptase PCR, RT-PCR），与前述PCR的不同之处在于首先需在一单引物的介导和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补链，该互补链称为cDNA，通过加热使逆转录酶失活后，加入另一引物，再以该cDNA为模板，在DNA聚合酶催化下合成目的双链DNA片段。逆转录PCR的模板可为细胞、病毒的总RNA或细胞mRNA，该方法常用于检测RNA病毒或研究真核细胞的基因表达,34,毒相关,标记引物PCR,是利用荧

13、光素、同位素或生物素等对PCR引物的5端进行标记，通过检测荧光素或者同位素，直接显示产物的存在；或者利用生物素亲合素系统与酶促反应结合，借助酶促反应的放大效应，显示目的片段的存在，更加提高PCR的灵敏度。,35,毒相关,不同荧光素标记不同引物 -彩色PCR PCR-ELISA法 -个引物的5端，使其携带便于PCR产物固定于微孔板的的功能基团，如生物素；而另一引物或者探针的5端修饰便于用酶连免疫吸附试验检测的基团如FITC，经此修饰后的引物仍能引导PCR的特异扩增反应，扩增后的产物不需电泳，直接加入链霉亲合素包被的聚丙乙烯微孔板，通过生物素与链霉亲合素反应，使产物以及生物素修饰的游离引物固定于微

14、孔板，但只有产物可与随后加入的HRP-抗FITC抗体结合，借助检测酶活性反映PCR产物的多少,36,毒相关,免疫PCR,是将抗原抗体的特异性反应与PCR技术结合起来，以检测微量蛋白质的方法。 如：将与被检物对应的单克隆抗体先吸附在固相载体上，然后使被检抗原与之反应，再用生物素化的特异性多抗结合此抗原，通过亲合素再与生物素化DNA相连结，再以适当的引物对DNA指示分子进行扩增，以扩增产物的有无与多少，反应待测抗原的存在与数量,37,毒相关,定量PCR,38,毒相关,实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定

15、量分析的方法。,39,毒相关,1.Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 Ct值。其含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。,40,毒相关,2.荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,41,毒相关,3.Ct值与起始模板的关系 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,42,毒相关,TaqMan荧光探

16、针： PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,43,毒相关,在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。,44,毒相关,45,毒相关,46,毒相关,荧光定量标准曲线,47,毒相关,总结,细菌性食物中毒的判断很重要 诊断标准主要以流行病学调查资料及病人的潜伏期和中毒的特有表现为依据，实验室诊断是为了确定中毒的病因而进行的,