大学生物化学之蛋白质课件.ppt

1、蛋白质概述,一、蛋白质的化学组成与分类 二、蛋白质的形状、大小和分子量 三、蛋白质功能的多样性,蛋白质的化学组成与分类,1.元素组成：蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、钼、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 50-55% 氢 6.5-7.3 氧 19-24 氮 16% 硫 0-3 其他 微 量,蛋白质的含氮量,大多数蛋白质的含氮量接近于16%，这是蛋白质元素组成的一个特点，也是凯氏（Kjedahl）定氮法测定蛋白质含量的计算基础。所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量： 样品中蛋白质

2、含量=蛋白氮 6.25 6.25为蛋白质系数，即1克氮所代表的蛋白质量（克数,蛋白质的分类,一、按化学组成分 1、单纯蛋白：只含蛋白成分 2、缀合蛋白：蛋白+辅基,单纯蛋白,单纯蛋白只含由-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。 1，清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。 2，谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于7080乙醇中。 3，精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。 4，硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、

3、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白,由单纯蛋白与其它非蛋白成分结合而成。 1、色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。 2、糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。 3、脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。 如血清-，-脂蛋白等。 4、核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等,缀合蛋白,蛋白质分子组成： 经酸、碱和酶处理蛋白质，使其彻底水解得到产物为氨基酸，组成蛋白质的常见20种氨基酸中除脯氨酸外，均为-氨基酸,不变部分,可变部分,蛋白质的形状、大小与分子量,蛋白质是分子量很大的生物分子。对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组

4、成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋白质,按形状和溶解度可将蛋白质分为： 1、纤维蛋白 2、球状蛋白 3、膜蛋白 按肽链构成分 1、单体蛋白 2、寡聚蛋白或多聚蛋白,蛋白质分子量的变化范围很大，从大约6000到1000000道尔顿（Da）或更大。 某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而成的，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。（TMV：4x107,1 D = 1.66033 10-27 Kg 对于只含有多肽链的简单蛋白质： 氨基酸残基的数目=蛋白质的分子量 / 110 （氨基酸残基平均分子量 110,John Dalton,三

5、、蛋白质功能的多样性,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,催化代谢反应。这是蛋白质的一个最重要的生物学功能,调节蛋白参与基因表达的调控。它们激活或抑制遗传信息转录为RNA 激素参与代谢调节,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,受体蛋白起接受和传递信息的作用,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,某些蛋白质具有转运功能，携带各种小分子、离子等从一处到另一处,有些蛋白质有贮藏氨基酸的作用，用作有机体生长发育的氮源。 如蛋类中的卵清蛋白为鸟类胚胎发育提供氮素 小麦

6、种子中的醇溶蛋白为种子发芽提供氮素,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,人和动物的运动，靠肌肉的收缩来实现，参与肌肉收缩的主要成分是肌球和肌动蛋白，没有肌球蛋白和肌动蛋白，就没有人和动物的运动,构建和维持生物体的结构，这类蛋白称为结构蛋白。 细胞的片层结构，如细胞膜、线粒体膜、叶绿体膜和内质网膜等都是由不溶性蛋白与脂类组成的。 在高等动物里，胶原蛋白参与结缔组织和骨骼的形成，作为身体的支架。 动物的毛发和指甲都是由角蛋白构成的,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,有些蛋白质具有主动

7、的防护功能，抵抗外界不利因素对生物体的干扰。 如脊椎动物体内的免疫球蛋白（抗体），能中和外来有害物质（抗原）。 抗冻蛋白：南极水域中某些鱼类血液中含有，保护血液不被冻凝。 蛇毒和蜂毒的溶血蛋白和神经毒蛋白以及一些植物毒蛋白（蓖麻蛋白）等少量可引起高等动物产生强烈毒性反应,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,应乐果甜蛋白有着极高的甜度，作甜味剂。 某些海洋生物如贝类，分泌一类胶质蛋白，能将贝壳牢固地粘在岩石或其他硬表面上,催化 调节 受体 转运 贮存 运动 结构成分 防御 异常功能,综上所述：蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质

8、是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程,蛋白质的分子结构,一、蛋白质的一级结构 二、蛋白质的二级结构和纤维状蛋白 三、蛋白质的三级结构 四、蛋白质的四级结构,蛋白质的结构,蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。 蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质,蛋白质的一级结构,1. 定义 1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC） 规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础,胰岛素（insulin ）的一级

9、结构,胰岛素的分子量为5734道尔顿，由51个氨基酸组成。 含A、B两条链，（A链：21肽 ，B链：30肽,A链和B链之间由两个链间二硫键（A7-B7,A20-B19)连接，A链本身第6位和第11位的2个Cys残基之间形成一个链内二硫键,胰岛素是动物胰脏细胞分泌的一种分子量较小的激素蛋白，主要功能是降低体内血糖含量,肽（peptide,一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽,一、肽与肽键,由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基,肽键（peptide bond,0.127nm 键长=0.13

10、2nm 0.148nm,肽平面：构成肽键的四个原子（C、O、N、H）和与之相连的两个碳原子都处在同一个平面内，此刚性结构的平面称肽平面或酰氨平面,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转,肽键,肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 在大多数情况下，以反式结构存在,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序 通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述

11、五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,二、肽链中AA的排列顺序和命名,从肽链的N-末端开始，残基用酰称呼。 例如：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸, 简写：Ser-Gly-Tyr - Ala - Leu， 书写时，通常把NH2末端AA残基放在左边，COOH末端AA残基放在右边。 共价主链：肽链的骨干是由-N -C -C -序列重复排列而成，称为共价主链,肽的命名,四肽的结构,三、肽的重要理化性质,1.每种肽也有其晶体，晶体的熔点都很高。 2.在pH0-14范围内，肽的酸碱性质主要来自游离末端-NH2和游离末端-COOH以及侧链上可解离的基团。 3.每一种肽都有其相应的等电点，计

12、算方法与AA一致且复杂。 B2,B,B,B,B2,K1,K2,K3,K4,pI=pK2+ pK3/2,4. 肽的化学反应：也能发生茚三酮反应、 Sanger反应、DNS反应和Edman反应；还可发生双缩脲反应,双缩脲反应,含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。这是多肽定量测定的重要反应,双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子NH3而得到的产物,肽和蛋白质所特有而氨基酸所没有的颜色反应,四、 天然存在的重要多肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。 但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的

13、生理功能，常称为活性肽（active peptide）。 如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等,与真核生物的RNA聚合酶和牢固结合,H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽,L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val L-Orn L-Orn L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu 短杆菌肽S(环十肽) 由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些非蛋白氨基酸。如鸟氨酸（Ornithine, 缩写为 Orn,能抗革兰氏阳性菌，对阴性细菌如绿脓杆菌、变性菌

14、也有效。临床上用于治疗和预防化脓性病症,CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH,CH2,CH2,CHNH2,COOH,CH2,SH,2.蛋白质一级结构的测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定,测定蛋白质氨基酸顺序的重要意义,测定蛋白质中的AA顺序，是走向阐明其生物功能基础中的很重要步骤。顺序可以给出更多的信息。 为了了解多肽链折叠成三维构象所受到的限制，顺序测定是必须的。 AA顺序的改变可以导致异常的功能和疾病，所以顺序测定是分子病理学的一个重要部分。 蛋白质中的AA顺序很

15、能指明它的进化史,a、样品必需纯（97%以上）； b、知道蛋白质的分子量；可以预测AA数目，工作量大小。 c、知道蛋白质由几个亚基组成,1）测定蛋白质一级结构的要求,2) 测定步骤,A.测定蛋白质分子中多肽链的数目和种类。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目,蛋白质一级结构的测定,B.多肽链的拆分。 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分,蛋白质一级结构的测定,B.多肽链的拆分。 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基). 尿素和

16、盐酸胍与蛋白质的可能作用方式： a.与肽链竞争氢键 b.增加非极性侧链在 水中的溶解度,蛋白质一级结构的测定,NH,脲或胍,C.二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化,蛋白质一级结构的测定,SH-CH2-CH2-OH,可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键,蛋白质一级结构的测定,s,s,HcoooH,SO3H,SO3H,2020/12/18,48,可编辑,S,S,S,S,

17、S,S,胰岛素,HO-CH2-CH2-SH,SH,SH,SH,SH,SH,SH,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,SCH2C00H,ICH2COOH,还原 保护,D.分析多肽链的N-末端和C-末端。 多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法,蛋白质一级结构的测定,N-端氨基酸分析：Sanger反应、Edman反应、与丹磺酰氯反应、氨肽酶法。 C-端氨基酸分析,又称Sanger法。2,4-二硝基氟苯与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生

18、物（DNP-蛋白质）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定,N-末端基氨基酸测定,1）二硝基氟苯（DNFB）法,丹磺酰氯（DNS）与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到DNS-蛋白质，水解得DNS氨基酸。 此法的优点是DNS-氨基酸有很强的荧光性质，不需提取可直接检测，检测灵敏度高,N-末端基氨基酸测定,2）丹磺酰氯法,3） PITC法（ Edman 法,N-末端基氨基酸测定,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动

19、力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大,N-末端基氨基酸测定,4）氨肽酶法,此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离,肼解法,还原法,肽链 C末端氨基酸可用硼氢化锂还原成相应的氨基醇，再用层析法加以鉴定。Sanger早期就是采用这个方法鉴定胰岛素A、B链的C末端氨基酸,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从

20、而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键,羧肽酶(carboxypeptidase)法,E.多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来,多肽链断裂法：酶解法和化学法,酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶等,Trypsin ：R1=Lys和Arg时（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro 水解受抑,水解位点,胰蛋白酶,或胰凝乳

21、蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe, Trp,Tyr时水解快; R1= Leu，Met和His水解稍慢。 R2=Pro 水解受抑,肽链,水解位点,糜蛋白酶,Pepsin：R1和R2Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。 R1=Pro 水解受抑,肽链,水解位点,胃蛋白酶,thermolysin：R2=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。 R2=Pro或Gly 水解受抑。 R1或R3=Pro 水解受抑,肽链,水解位点,嗜热菌蛋白酶,谷氨酸蛋白酶： R1=Glu、Asp(磷酸缓冲液); R1=Glu

22、 (磷酸缓冲液或醋酸缓冲液) 精氨酸蛋白酶： R1=Arg,肽链,水解位点,谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶,木瓜蛋白酶（R1=Arg,GlyAlaLeuGluAsp） 和弹性蛋白酶(R1=AlaValGlySer,化学法：可获得较大的肽段 溴化氰(Cyanogen bromide)水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键,羟胺（NH2OH）：专一性断裂-Asn-Gly-之间的肽键。也能部分裂解-Asn-Leu-之间的肽键以及-Asn-Ala-之间的肽键,F.分离肽段测定每个肽段的氨基酸顺序,蛋白质一级结构的测定,测定每条多肽链的氨基酸组成,Edman反应,2、氨肽酶法或羧肽酶法,3、质谱法（MS） 灵敏度高、所需样品少、测定速度快,核糖体,蛋白质链,4.根据核苷酸序列的推定法,G.确定肽段在多肽链中的次序。 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序,H.确定原多肽链中二硫键的位置,采用胃蛋白酶水解：切点多，二硫键稳定,一般采用胃蛋白酶处理含有二硫键的多肽链(切点多；酸性环境下防止二硫键发生交换)。 将所得的肽段利用Brown及Hartlay的对角线电泳技术进行分离,第二向,第一向,Brown和Hartlay对角线电泳图解,pH6.5 图中黄色斑点是 含有