微生物工程：第五部分 发酵过程及过程控制

1、第五部分 发酵过程及过程控制,发酵过程即细胞的生物反应过程，是指生长繁殖的细胞所引起的生物反应过程。 微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种本身的性能，而且要赋予合适的环境条件才能使它的生产能力充分表达出来 培养基、培养温度、pH、氧的需求等 菌体浓度，糖、氮消耗及产物浓度，以及采用传感器测定发酵罐中的培养温度pH、溶解氧等参数的情况,第十章 发酵动力学 第十一章 发酵工艺条件控制 第十二章 相关发酵发酵罐设备,第十章 发酵过程动力学,什么是发酵动力学？,发酵动力学：研究微生物生长、产物合成、底物消耗之间动态定量关系，定量描述微生物 生长 和 产物形成 过程。 主要研究： 1、发酵动力学参数特

2、征：微生物生长速率、发酵产物合成速率、底物消耗速率及其转化率、效率等； 2、影响发酵动力学参数的各种理化因子； 3、发酵动力学的数学模型。,认识发酵过程的规律 优化发酵工艺条件，确定最优发酵过程参数，如：基质浓度、温度、pH、溶氧，等等 提高发酵产量、效率和转化率等,研究发酵动力学的目的,本章主要内容,分批发酵动力学 连续发酵动力学 补料分批发酵动力学,一 分批发酵,分批发酵：准封闭培养，指一次性投料、接种直到发酵结束，属典型的非稳态过程。 分批发酵过程中，微生物生长通常要经历延滞期、对数生长期、衰减期、稳定期（静止期）和衰亡期五个时期。,典型的分批发酵工艺流程图,分批发酵过程,分批发酵动力学

3、,细胞生长动力学 基质消耗动力学 产物形成动力学,t1 t2 t3 t4 t5,分批发酵时典型的微生物生长动力学曲线,菌体浓度X,时间 t,分批发酵动力学-细胞生长动力学,微生物生长特性通常以单位细胞浓度或细 胞数量在单位时间内的增加量来表示（、n）：,或,X细胞浓度（g/L）；N细胞个数； t生长时间； X0、Xt初始微生物浓度和t时细胞浓度； N0、Nt初始细胞个数和t时细胞个数； 以细胞浓度表示的比生长速率； 以细胞数量表示的比生长速率。,分批发酵动力学-细胞生长动力学,lag: x不变, 即 exp:(假定无抑制作用存在),分批发酵动力学-细胞生长动力学,Decline（开始出现一种底

4、物不足的限制）: 若不存在抑制物时 Monod 模型:,分批发酵动力学-细胞生长动力学,式中: S限制性基质浓度，mol/m3 Ks底物亲和常数(也称半饱和速度常数），表示微生物对底物的亲和力 , mol/m3 ； Ks越大，亲和力越小， 越小。 当S较高时，(对数期满足S10Ks)，此时，= m 当S较低时，(减速期， S10Ks)，此时S， 减速期， ,分批发酵动力学-细胞生长动力学,比生长素率,限制性底物残留浓度St,残留的限制性底物浓度对微生物比生长率的影响,表征与培养基中残留的生长限制性底物St的关系,Monod方程：,Ks底物亲和常数，等于处于1/2m时的底物浓度，表征微生物对底物

5、的亲和力，两者成反比。,Monod方程应用： 测定微生物对不同底物的亲和力大小（Ks值） 实验确定适于微生物生长的最佳底物 比较不同底物发酵最终残留的大小 比较不同微生物对同一底物的竞争优势，确定连续培养的稀释率,Stationary（不生长或生长率与死亡率相等）: dying:,（浓度最大）,分批发酵动力学-细胞生长动力学,(比死亡速率 ，s-1),分批发酵动力学,假定整个生长阶段无抑制物作用存在，则微生物生长动力学可用阶段函数表示如下： 0 x0 （0tt1) m x0e m t (t1tt2) = x= x0e m(t2-t1) e t (t2tt3) 0 xm (t3tt4) -a x

6、me -a t (t4tt5),得率系数,指消耗单位营养物所生成的细胞或产物数量。其大小取决于生物学参数（,x ）和化学参数（DO,C/N,磷含量等） （1）生长得率系数 Yx/s、Yx/o、Yx/kcal：消耗每克营养物、每克分子氧以及每千卡能量所生成的细胞克数； Yx/c、 Yx/N、 Yx/p、Yx/Ave- ：消耗每克C、每克N、每克P和每个有效电子所生成的细胞克数； Yx/ATP：消耗每克分子的三磷酸腺苷生成的细胞克数。,分批发酵动力学-基质消耗动力学,消耗每克营养物（s）或每克分子氧(O2)生成的产物(P)、ATP或CO2的克数。,分批发酵动力学-基质消耗动力学,产物得率系数：,：

7、,定义：表观得率 专一性得率 *专一性用于生长的底物量S不含用于维持能耗及产物形成部分的用量。,分批发酵动力学-基质消耗动力学,基质消耗速率与生长、合成关系如下： 表观： 专一性：,分批发酵动力学-基质消耗动力学,为了扣除细胞量的影响， 定义：基质比消耗速率 产物比生成速率,分批发酵动力学-基质消耗动力学,=,若生长阶段产物生成可以忽略，即,分批发酵动力学-基质消耗动力学,1/Yx/s,1/ ,1/YG,m,图解法求微生物的本征参数YG和m,分批发酵动力学-基质消耗动力学,若生产阶段微生物生长可以忽略，,分批发酵动力学-基质消耗动力学,=,图解法求微生物的本征参数Yp和m,1/Yp/s,1/q

8、p,m,1/YP,根据发酵时间过程分析，微生物生长与产物合成存在以下三种关系： 与生长相关生长偶联型 与生长部分相关生长部分偶联型 与生长不相关无关联,分批发酵动力学-产物形成动力学,相关型,部分相关型,与生长相关生长偶联型：乙醇发酵,产物的生成是微生物细胞主要能量代谢的直 接结果，菌体生长速率的变化与产物生成速率的 变化相平行。,分批发酵动力学-产物形成动力学,与生长部分相关生长部分偶联型：柠檬酸、氨基酸发酵,产物间接由能量代谢生成，不是底物的 直接氧化产物，而是菌体内生物氧化过程的 主流产物（与初生代谢紧密关联）。,分批发酵动力学-产物形成动力学,与生长不相关无关联：抗生素发酵,若考虑到产

9、物可能存在分解时，则,产物生成与能量代谢不直接相关，通过细胞 进行的独特的生物合成反应而生成。,分批发酵动力学-产物形成动力学,分批发酵的优缺点,优点： 操作简单、投资少 运行周期短 染菌机会减少 生产过程、产品质量较易控制 缺点： 不利于测定过程动力学，存在底物限制或抑制问题，会出现底物分解阻遏效应及二次生长现象。 对底物类型及初始高浓度敏感的次级代谢物如一些抗生素等就不适合用分批发酵（生长与合成条件差别大） 养分会耗竭快，无法维持微生物继续生长和生产 非生产时间长，生产率较低,连续发酵动力学,什么是连续发酵？,连续发酵概念： 在发酵过程中，连续向发酵罐流加培养基，同时以相同流量从发酵罐中取

10、出培养液。 连续发酵特点： 添加培养基的同时，放出等体积发酵液，形成连续生产过程，获得相对稳定的连续发酵状态。 连续发酵类型： 单级 多级连续发酵,（一）连续发酵类型及装置 （二）连续发酵动力学模型 1.单级恒化器连续发酵 2.多级恒化器连续发酵 3.进行细胞回流的单级恒化器连续发酵 （三）连续发酵动力学理论的应用,主要内容,连续发酵类型及装置 罐式连续发酵 单级 多级串联 细胞回流式 塞流式连续发酵,连续发酵动力学-发酵装置,单级连续发酵示意图,连续发酵动力学-发酵装置-单级,两个及以上的发酵罐串联起来，前一级发酵罐的出 料作为下一级发酵罐的进料。,连续发酵动力学-发酵装置-多级串联,两级连

11、续发酵示意图,罐式连续发酵实现方法 恒浊法：通过调节营养物的流加速度，利用浊度计检测细胞浓度，使之恒定。 恒化法：保持某一限制性基质在一恒定浓度水平，使菌的比生长速率保持一定。,多级罐式连续发酵装置示意图,连续发酵动力学-发酵装置-多级串联,a: 再循环比率（回流比） c: 浓缩因子,细胞回流的单级连续发酵示意图,连续发酵动力学-发酵装置-细胞回流式,发酵罐,培养物流出,无菌培养基流入,供给连续接种再循环,d,连续发酵动力学-发酵装置-塞流式,定义： 稀释率 D=F/V (h-1) F流量（m3/h） V培养液体积（m3） 理论停留时间,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,细胞的物料衡算

12、（和D的关系）,对于单级恒化器：X0 =0 且通常有：,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,积累的细胞（净增量）= 流入的细胞-流出的细胞+生长的细 胞-死亡的细胞,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,A.稳定状态时，,此时 =D（单级连续发酵重要特征）,B.不稳定时，,当D，,当D，,积累的营养组分=流入量-流出量-生长消耗量- 维持生命需要量-形成产物消耗量 稳态时， =0,一般条件下,mx 产物相对菌体生长量较少,限制性基质的物料衡算,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,稳态时, 单级连续培养两个稳态方程是：,限制性基质的物料衡算,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发

13、酵,两个稳态方程隐含了几点假设： 对于一个特定微生物,具体操作参数(D) 来讲是常数 Yx/s只受一种限制性营养基质S的影响：S一定，一定，则Yx/s一定,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,细胞浓度与稀释率的关系（x与D的关系） 临界稀释率Dc 导致菌体开始从系统中洗出时的稀释率，当流入底物浓度为S0 时，临界稀释率Dc为：,稀释率D的大小不能超过连续发酵系统的临界稀释率,如果取 DDC ，则会出现：DDC 由 可知 负增长，x，进入非稳态， 菌体最终被洗出，即x=0 时，达到“清洗点”，此时，,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,细胞浓度与稀释率的关联（X与D的关系）,应用Mo

14、nod方程，此时，,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,生长模型,由两个稳态方程可以推出D与X关联的生长模型 当DDC 时， 细胞衡算 底物衡算,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,细胞生产率 当 即 时,可获得最大的细胞生产率，为,细胞生产率,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,若S0Ks （S010Ks）,底物供给浓度很大，为非限制性 则 此时，最大临界稀释率 当DDc= 时，,细胞生产率,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,x, s, Dx与D关系总结：,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,产物的物料衡算,产物变化率=细胞合成产物速率+流入-流出-分解项 当

15、连续发酵处于稳态， ， 且加料中不含产物，即 ，P分解速率可忽略。 得,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,几个假设： 只受单一底物限制 Yx/s对一定的来讲，为常数 DDC 若已知： 则,实 例,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,稀释率（D）对底物浓度(S)、细胞浓度(x)和细胞生产率(DX)的影响。,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,多级恒化器的第一级动力学模型,假设两级发酵罐内培养体积相同， 即V1=V2；且第二级不加入新鲜培养基， 则对于第一级动力学模型（方程）与单 级相同。,连续发酵动力学-理论-多级恒化器连续发酵,稳态时,连续发酵动力学-理论-多级恒化器连续发

16、酵,多级恒化器的第二级动力学模型, S1S0 ， S2S1 从第二级开始，比生长速率 不再等于稀释率D.,连续发酵动力学-理论-多级恒化器连续发酵,第二级细胞物料衡算,第二级稳态时， 同理,由稳态方程可得，,连续发酵动力学-理论-多级恒化器连续发酵,第二级基质物料衡算,稳态时，,连续发酵动力学-理论-多级恒化器连续发酵,连续发酵动力学-理论-多级恒化器连续发酵,第二级基质物料衡算,S2的求解,解此方程可得第二级发酵罐中稳态限制性基 质浓度S2,再由式(2)可确定x2,再求出Dx1,Dx2.,（1）（3）,连续发酵动力学-理论-多级恒化器连续发酵,细胞形成产物的速率：DP2,稳态时,连续发酵动力

17、学-理论-多级恒化器连续发酵,第二级发酵罐产物浓度,同理类推,连续发酵动力学-理论-多级恒化器连续发酵,二级连续发 酵中不同稀释率 下的稳态细胞浓 度、限制性基质 浓度和细胞生产 率的变化。,连续发酵动力学-理论-多级恒化器连续发酵,进行细胞回流的单级连续发酵,概念：进行单级连续发酵时，把发酵罐流出的发酵液进行分离，经浓缩的细胞悬浮液送回发酵罐中。,连续发酵动力学-理论-细胞回流单级恒化器连续发酵,优点：提高了发酵罐中的细胞浓度，也有利于提高系统的操作稳定性。,细胞生长动力学方程,细胞的物料衡算(与D的关系) 积累的细胞=进入培养液中的细胞+再循环流入的细胞 -流出的细胞+生长的细胞-死亡的细

18、胞,连续发酵动力学-理论-细胞回流单级恒化器连续发酵,假定: 细胞死亡很少（ =0） 培养基无菌加入（x0=0） D=F/V 由稳态条件 得,连续发酵动力学-理论-细胞回流单级恒化器连续发酵,限制性基质的物料衡算（x1与D的关系） 积累的基质 = 进入基质+循环流入基质-流出基质-消耗的基质,连续发酵动力学-理论-细胞回流单级恒化器连续发酵,代入有：,x1与D的关系,连续发酵动力学-理论-细胞回流单级恒化器连续发酵,D=F/V,稳态时，,连续发酵动力学-理论-细胞回流单级恒化器连续发酵, x1比单级无再循环的x要大,又,代入x1式, 得,假定分离器无细胞生长和基质消耗，则有细胞物料衡算式： 流

19、入分离器细胞=流出分离器细胞+ 再循环细胞,最终流出的细胞量xe与 D关系,连续发酵动力学-理论-细胞回流单级恒化器连续发酵,连续发酵动力学-理论-细胞回流单级恒化器连续发酵,细胞回流与不回流的单级连续发酵比较 A-细胞回流时的稳态X；B-细胞回流时的稳态DX；C-细胞回流时的稳态Xe；D-细胞不回流时的稳态X；E-细胞不回流时的稳态DX,应用,有助于了解和研究细胞生长、基质消耗和产物生成的动力学规律，从而优化发酵工艺。 便于研究细胞在不同比生长速率下的特征。,连续发酵动力学-理论,利用细胞再循环连续发酵技术进行废水的生化处理、发酵与产物分离耦合。 利用连续培养的选择性进行富集培养菌种选择及防

20、污染处理。,应用,连续发酵动力学-理论,连续发酵动力学-理论,在底物浓度为S情 况下杂菌Y的生长速 率y比系统的稀释 速率D要小 Y的积累速率 ：,结果是负值，表明杂菌不能在系统中存留,连续发酵动力学-理论,底物浓度为S的情 况下杂菌Z能以比D大 的比生长速率下生长,比D大的多，故 dZ/dt是正的，杂菌Z积累，系统中底物浓度下降到S，此时 D，建立新的稳态。此时生产菌X的比生长速率 比原有的小。 D，故将生产菌从系统中淘汰,连续发酵动力学-理论,杂菌W 入侵的成败取决于系统的稀释速率。 由图可见，在稀释速率为0.25Dc（临界稀 释速率）下，W竞争不过X而被冲走 .,连续培养中杂菌能否 积累

21、取决于它在培养系 统中的竞争能力,遗传稳定性研究 选择适当的物质作为限制性基质，可使连续发酵中细胞代谢产物的生产大大提高。 连续发酵提高生产率,应用,连续发酵动力学-理论,分批发酵：生产周期 式中：tL-延迟期所占用时间； tR放料时间 tP清洗发酵罐、培养基、灭菌、冷却所需时间 xF发酵终点细胞浓度； x0接种后细胞浓度 假定分批发酵的指数生长期延续到限制性基质耗尽，这时达到最大细胞浓度xF,应用-提高生产率,连续发酵动力学-理论,分批发酵的细胞生产率为:,连续发酵动力学-理论,应用-提高生产率,可见,细胞的m越大，辅助操作时间越长，连续发酵的优势就越大。,应用 -单级连续发酵最大生产率,连

22、续发酵动力学-理论,单级连续发酵与分批发酵最大生产率之比为：,优缺点,添加新鲜培养基，克服养分不足所导致的发酵过程过早结束，延长对数生长期，增加生物量等； 在长时间发酵中，菌种易于发生变异，并容易染上杂菌； 如果操作不当，新加入的培养基与原有培养基不易完全混合。,连续发酵动力学-理论,什么是补料分批发酵？,补料分批培养（Fed-batch culture）： 分批发酵过程中补充培养基，不从发酵体系中排出发酵液，使发酵液的体积随着发酵时间逐渐增加 。,概念：在发酵过程中，不连续地向发酵罐内加入培养基，但不取出发酵液的发酵方式。 特点：由于培养基的加入，发酵液体积不断增加。,补料分批发酵动力学,类

23、型,连续流加 补料方式 不连续流加 多周期流加 快速流加 恒速流加 变速流加 单一组分补料 多组分补料,流加方式,补料分批发酵动力学,以补加的培养基成分来区分,整个发酵罐中细胞、限制性基质和产物总量的变化速率可用下式表示： ,补料分批发酵动力学,细胞总量的变化率为 若为恒速流加，培养基流量为F， 则 合并、式 得,补料分批发酵动力学,同样可以推导出限制性基质和产物浓度的变化率： 合并、式 得,补料分批发酵动力学,又 ,补料分批发酵动力学,拟稳态时 这时,补料分批发酵动力学,对于恒速流加，细胞的比生长速率对时间的变化率为： 长时间流加培养之后,补料分批发酵动力学,可以解除底物的抑制、产物反馈抑制

24、和葡萄糖分解阻遏效应。 避免在分批发酵中因一次性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多，以至通风搅拌设备不能匹配的状况。 菌体可被控制在一系列连续的过渡态阶段，可用来作为控制细胞质量的手段。 与连续发酵相比，补料分批发酵的优点在于：无菌要求低；菌种变异，退化少；适用范围更广。,补料分批发酵动力学,优点,第十一 章 发酵工艺条件控制,一、温度的影响及控制,发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。 从阿累尼乌斯方程式可以看到 dlnKr/dt=E/RT2 积分得 E=,E活化能,Kr速率常数,1 温度对微生物细胞生长的影响：影响各种酶促反应的速度 2 温度对产物形成的影响,（一）温度

25、对发酵的影响,结论：温度对菌的生长、产物合成的影响可能是不同的,根据计算 青霉素菌生长活化能E=34kJ/mol 呼吸活化能E=71kJ/mol 青霉素形成的活化能E=112kJ/mol 结论：偏离最适温度引起的生产率下降比其他两个参数的变化更为严重。,3改变发酵液的物理性质，间接影响菌的生物合成 。 4 影响生物合成方向。 e.g. 四环素发酵中金色链霉菌：T30，产生金霉素；T达35 ，产生四环素； 谷氨酸发酵中扩展短杆菌： 30培养后37 发酵，积累过量乳酸。 温度对菌的调节机制关系密切 。,（二） 发酵过程引起温度变化的因素,发酵热Q发酵,生物热：产生菌在生长繁殖过程中，释放的大量热量

26、。,搅拌热：由于搅拌器的转动引起液体的摩擦产生的热量。,蒸发热：发酵液蒸发水分带走的热量。,显热：发酵排气散发带走的热量。,辐射热：由于罐内外的温差，辐射带走的热量。,可根据实测发酵过程中物质平衡计算生物热。例如某味精厂50M3发酵罐发酵过程测定结果的主要物质变化如表：,发酵1218小时的生物热为： Q生物24159555.90.612309.2610634.51.22093415.415449.3191098.1KJ/M3 191098.1631849.7 每小时的生物热为31849.7KJ/M3,（三）最适发酵温度的选择,选择既适合菌体生长又适合代谢产物合成的温度,可实行变温控制：在生长阶

27、段选择适合菌体生长的温度，在产物合成阶段，选择适合代谢产物合成的温度。,确定最适发酵温度还应参考其它发酵条件： 在较差通气条件下，降低发酵温度对发酵有利 培养基成分较易被利用或较稀薄时，降低发酵温度有利,（四）发酵温度的控制,在发酵罐上安装夹套和蛇罐，通过循环冷却水控制。,冷却介质：深井水或冷冻水,控制方式：手动控制或自动控制,二 pH的影响及控制,（一）pH对发酵的影响：,影响菌体生长代谢的酶活性,影响代谢产物的合成方向 e.g. 黑曲霉发酵：pH23, 柠檬酸；pH接近中性，草酸 酵母菌发酵：pH4.55.0，酒精；pH8.0，酒精、醋酸 和甘油 谷氨酸发酵：pH7.08.0，谷氨酸；pH

28、5.05.8, 谷酰胺 和N-乙酰谷酰胺,影响菌体原生质膜电荷的改变，引起膜对离子的渗透作用，影响了营养物的吸收和代谢产物的分泌。,pH的变化决定于所用的生产菌： 培养基中营养物质的代谢引起pH的变化： 培养基pH在发酵过程中能被菌体代谢所改变。若阴离子氮源被利用后产生NH3 ，则pH上升；有机酸的积累，使pH下降。 一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性pH转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH转移，这都跟碳氮比直接有关。 生理酸性物质和生理碱性物质的消耗,（二）影响发酵pH变化的因素：,根据不同菌种的生理特性，确定不同的最适pH 同一菌种根据不同阶段，生长期采用最适生长的pH， 在产物采用最适产物

29、合成的pH。,（三）最适pH的选择,（四）pH的控制,采用合适的培养基配比 C：N合适 生理酸性物质和生理碱性物质比例合适 添加缓冲物质：碳酸钙和磷酸盐 在发酵过程中直接补加酸或碱 过去流加硫酸或氢氧化钠， 现采用补加氨水、尿素、硫酸铵 在发酵过程中调节补糖速度控制pH 发酵的不同阶段采取不同的pH值,以青霉素发酵为例，最适pH为6.66.9,在不同pH范围内加糖，青霉素产量和糖耗不一样。 pH范围 糖耗 残糖 青霉素相对单位 pH6.06.3加糖 10% 0.5% 较高 pH6.66.9加糖 7% 0.2% 高 pH7.37.6 加糖 7% 0.5% 低 pH6.8控制加糖 7% 0.2%

30、最高 速率恒定(0.055%/h),控制方案： 方案一：培养基中供应充足的糖，并配用pH缓冲剂 方案二：培养基中供应充足的糖，以非基质NaOH调节pH 方案三：在发酵过程中恒速补糖，以NaOH、H2SO4调节pH 方案四：改变补糖速率来控制pH为6.66.9,pH控制系统,给定值,补料,pH电极,mA,420mA,溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因素。,在28氧在发酵液中的100的空气饱和浓度只有0.25 mmol.L-1左右，比糖的溶解度小7000倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧

31、可在几秒（分）钟之内便耗竭，使溶氧成为限制因素。,三 氧的供需及对发酵的影响,1 基本概念,比耗氧速度或呼吸强度（QO2）：单位时间内单位重量的细胞所消耗的氧气，mmol O2g菌-1h-1,摄氧率(r)：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmol O2L-1h-1 。,r= QO2 .X,CCr,QO2,CL,CCr: 临界溶氧浓度, 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。,一般对于微生物： CCr: 115%饱和浓度,例：酵母 4.6*10-3 mmol.L-1, 1.8% 产黄青霉 2.2*10-2 mmol.L-1, 8.8%,定义：氧饱和度发酵液中氧的浓度/临界溶氧溶度,所以对于微

32、生物生长，只要控制发酵过程中氧饱和度1.,问题：一般微生物的临界溶氧浓度很小，是不是发酵过程中 氧很容易满足。,例：以微生物的摄氧率0.052 mmol O2L-1S-1 计， 0.25/0.052=4.8秒,2 影响需氧的因素,r= QO2 .X,菌体浓度,QO2,遗传因素,菌龄,营养的成分与浓度,有害物质的积累,培养条件,3 反应器中氧的传递,发酵液中氧的传递方程,C,Ci,P,Pi,气膜,液膜,N：传氧速率 kmol/m2.h kg: 气膜传质系数 kmol/m2.h.atm Kl: 液膜传质系数 m/h,（1） 发酵液中氧的平衡,发酵液中供氧和需氧始终处于一个动态的平衡中,传递：,消耗

33、：,r= QO2 .X,若需氧量供氧量，则生产能力受设备限制，需进一步提高传递能力； 若需氧量供氧量，则生产能力受微生物限制，需筛选高产菌：呼吸强，生长快，代谢旺盛。 供氧与耗氧至少必须平衡，此时可用下式表示：,（2 ）供氧的调节,C有一定的工艺要求，所以可以通过Kla 和C*来调节 其中C*P*H,Nv,H,P,Kla,调节Kla是最常用的方法， kla反映了设备的供氧能力。,（3） 影响Kla的因素,Kla反映了设备的供氧能力。 发酵常用的设备为：摇瓶 发酵罐,影响摇瓶kla的因素,为装液量和摇瓶机的种类,摇瓶机,往复，频率80-120分/次，振幅8cm,旋转，偏心距25、12,转述250

34、rpm,影响发酵罐中Kla的因素,已知在通风搅拌发酵罐中，全挡板条件下：,理论上分析,KLa,n,d,通气量,提高搅拌，调节kla的效果显著,影响KLa的因素,发酵罐的形状，结构（几何参数） 搅拌器，空气分布器（几何参数） 通气：表观线速度Ws 操作条件 搅拌：转速N，搅拌功率PG 发酵液体积V，液柱高度HL 发酵液的性质：如影响发酵液性质的表面活性剂、离子 强度、菌体量,设备参数,搅拌器形式的影响: 、数值不同,对于值:弯叶平叶箭叶 对于值:弯叶箭叶平叶 但是破碎细胞能力: 平叶箭叶弯叶 翻动流体能力: 箭叶弯叶平叶 此外，搅拌器的直径大小、组数、搅拌器间距以及在罐内的相对位置等对KLa都有

35、影响.,A. 搅拌对KLa的影响,转速NPG KLa 搅拌作用(影响KLa原理) 将通入培养液的空气分散成细小的气泡，防止小气泡的凝并，从而增大气液相的接触面积，即aKLa溶氧 搅拌产生涡流，延长气泡在液体中的停留时间，溶氧 搅拌造成湍流，减小气泡外滞流液膜的厚度，从而减小传递过程的阻力，即1/KLKLKLa溶氧 搅拌使菌体分散，避免结团，有利于固液传递中接 触面积的增加，使推动力均一；同时，也减少菌体 表面液膜的厚度，有利于氧的传递。,搅拌对KLa的影响（续）,N并不是越大越好 剪切力， 对细胞损伤，对形态破坏 PG,发酵期间搅拌热,增加传热负荷,N,B. 通气对KLa的影响:,在通气量Q较

36、低时, QWs KLa,当通气量超过一定上限时, 搅拌器就不能有效地将空气泡分散到液体中去, 而在大量气泡中空转, 发生“过载”现象, 此时搅拌功率PG会大大下降, KLa也会大大下降。 只有Q，N同时提高，PG才不会大大 下降，KLa。,C. 通气、搅拌的关联对KLa的影响,综合三类影响因素，有 其中 d搅拌器直径，m ; 搅拌器转速，s-1 ; 液体密度，kg/m3; 液体粘度，Pas ; DL扩散系数, m2/s ; 界面张力，N/m; Ws 表观线速度，m/s ; g重力加速度, 9.81m/s2,典型的分批发酵中氧浓度的变化规律（一定Kla下）：,4 溶氧浓度的变化及其控制,批式发酵

37、无DO控制情况下，溶氧变化规律为“波谷现象”,溶氧、x、QO2、 随时间变化的关系,值得注意的几点,自然“波谷现象”，一般可以自适应调节（ ） 当 ，则需要控制，增加OTR，防止需氧受阻。 补料与“波谷现象”对应：即补料时间、剂量选择与溶氧变化有关。 a.不能在波谷时补料，加重缺氧 b. 一次补料不能过量，防止 ， 菌体停止呼吸、死亡 c.每次补料都会引起一次大的溶氧下降。,（1）溶解氧对生长的影响,临界氧浓度（CCr）： 当 时, 当 时, 对生长应满足 , 但并不是越高越好,呼吸抑制,呼吸不受抑制,指不影响菌体呼吸所允许的最低 氧浓度。,（2）溶解氧对产物合成的影响,最适氧浓度（Cm）：溶

38、氧浓度对产物合成有一个最适范围，CL过高或过低，对合成都不利。 e.g.卷须霉素：1270h之间，维持CL 在10%比在0或45%的产量要高。,（3）CCr与Cm比较：通常Cm与CCr不一致,对于某些菌株 CcrCm, 卷须霉素: 而有些菌株 Ccr Cm, 头孢菌素C：,Cm 8%,生长阶段要求CL CCr，生产阶段满足CLCm。,溶解氧控制作为发酵中间控制的手段之一,控制原理 发酵过程中， 糖量 x , QO2 CL 糖量 QO2 CL 补糖使CL下降，而CL回升的快慢取决于供氧效率。 对于一个具体的发酵，存在一个最适氧浓度（Cm）水平，补糖速率应与其相适应。,，加大补糖速率,，减小补糖速

39、率,实现用溶解氧水平控制补料速率,补糖速率控制在正好使生产菌处于所谓“半饥饿状态”，使其仅能维持正常的生长代谢，即把更多的糖用于产物合成，并永远不超过罐设计时的KLa水平所能提供的最大供氧速率。 一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一定要把握好。,控制原则,发酵异常指标,发酵中污染杂菌，溶解氧发生异常变化。 对于好气性杂菌，溶解氧会一反往常在较短时间内跌到零附近，跌零后长时间不回升。 对于厌气性杂菌，溶解氧升高。 污染噬菌体或其它不明原因引起 发

40、酵液变稀，此时溶解氧迅速上升。 操作故障或事故分析,谷氨酸正常发酵和异常发酵的溶解氧曲线 正常发酵溶解氧曲线 -异常发酵溶解氧曲线 异常发酵光密度曲线,四 二氧化碳对发酵的影响及控制,作为代谢产物或中间前体，尾气中CO2积累与生物量 成正比，通过C质量平衡估算生长速率和细胞量。 高浓度CO2对发酵多表现为抑制作用，应实施测量与 控制； 尾气CO2不仅直接反映代谢情况，而且和其它参数及补料操作密切相关，可作为工艺优化的指标。,在青霉素发酵中补糖将引起排气CO2增加，同时pH下降。 糖、CO2、pH三者的相关性，被青霉素工业生产上用于补料控制的参数，并认为排气CO2的变化比pH变化更为敏感，所以测

41、定排气CO2释放率 （CER）来控制补糖速率。,补糖对排气CO2和pH的影响,菌体浓度的增加速度（生长速度）与微生物的种类和自身的遗传特性有关,五 菌体生长速度和菌体浓度的影响及控制,（一）影响菌体浓度的因素,菌体浓度的增加速度（生长速度）与营养基质的种类和浓度有关 （ 正比于S ）,当存在基质抑制作用时或造成高渗透压时，高浓度营养基质引起生长速率下降。,菌体浓度的增加速度（生长速度）受环境条件的影响,最适菌体浓度的确定,优化控制的目标：在最短的时间内产生最大量的产物。(dP/dtMAX),dP/dt =qP X,qP=f X， ， qO 2 qS CL,以青霉素发酵为例,青霉素发酵的qP与的

42、关系, C qP可维持在qPmax, C qP随减小而减小,要保证生产菌获得最大的比生产速率，就必须维持较大的比生长速率。 但是，过高的比生长速率造成过高的菌体浓度，造成不利影响：,过高的比生长速率和过高的菌体浓度造成的不利影响：,1、 过高，S消耗过快，有限的营养基质只能用于生长，而不足于产物合成。,2、有毒中间产物的快速积累，会改变菌体的代谢途径，抑制产物合成。,3、 X过高，增加OUR，且发酵液粘度增大，减小OTR。 CL减小，抑制菌体生长和产物合成。,最适X？,最适为等于或稍大于C,青霉素发酵的qP、OUR、OTR与X的关系,OUR=OTR时的菌体浓度为最适菌体浓度，,在发酵过程中，控

43、制目标为保持稳定的临界菌体浓度和临界比生长速率，以维持呼吸临界溶氧浓度为前提的耗氧速率与供氧速率的平衡，从而使产物合成速率和比速率达到最大值。,六 发酵过程泡沫的形成与控制,发酵过程起泡的利弊：气体分散、增加气液接触面积，但过多的泡沫是有害的,1 发酵过程泡沫产生的原因,（1）通气搅拌的强烈程度,通气大、搅拌强烈可使泡沫增多，因此在发酵前期由于培养基营养成分消耗少，培养基成分丰富，易起泡。应先开小通气量，再逐步加大。搅拌转速也如此。也可在基础料中加入消泡剂。,（2）培养基配比与原料组成,培养基营养丰富，黏度大，产生泡沫多而持久，前期难开搅拌。 例：在50L罐中投料10L，成分为淀粉水解糖、豆饼

44、水解液、玉米浆等，搅拌900 rpm，通气，泡沫生成量为培养基的2倍。如培养基适当稀一些，接种量大一些，生长速度快些，前期就容易开搅拌。,（3）菌种、种子质量和接种量,菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生几率也就少。菌种生长慢的可以加大接种量,（4）灭菌质量,培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。,2 起泡的危害,（1）降低生产能力,在发酵罐中，为了容纳泡沫，防止溢出而降低装量,（2）引起原料浪费,如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地，气泡会引起原料流失，造成浪费。,（3）影响菌的呼吸,如果气泡稳定，不破碎，那么随着微生物

45、的呼吸，气泡中充满二氧化碳，而且又不能与空气中氧进行交换，这样就影响了菌的呼吸。,(4)引起染菌,由于泡沫增多而引起逃液，于是在排气管中粘上培养基，就会长菌。随着时间延长，杂菌会长入发酵罐而造成染菌。大量泡沫由罐顶进一步渗到轴封，轴封处的润滑油可起点消泡作用，从轴封处落下的泡沫往往引起杂菌污染。,3 消泡方法,机械方法：消沫桨 超声波 消泡剂,（1）天然油脂,（2）聚醚类消泡剂,（3）高碳醇,（4）硅酮类,发酵过程优化控制举例,鸟苷发酵过程优化与多尺度研究,项目背景,鸟苷是呈味核苷酸二钠“I+G”的重要原料， 七十年代上海工业微生物研究所开始研究 发酵水平：7克/升 12克/升 没有形成产业

46、广东星湖公司从工微所购买上述菌株，经过多年研究开发： 发酵水平： 12克/升 16克/升,项目背景,2000年I+G 产品首次独家面市，遇到日本冲击，同年9月投资2 .1亿的新开发厂区全面停产。 16g/L 25g/L （盈亏持平）,参数相关分析与状态方程建立 通过鸟苷发酵过程的数据采集发现： 40小时OUR下降，补糖速率不变， 鸟苷产率迅速下降代谢流迁移,生物反应器：测量观察值,多尺度：细胞代谢流,状态方程建立与系统识别,代谢途径迁移的酶学测试 HMP途经EMP途经,化学计量学方法的代谢流研究,关键技术,菌体生理形态变异与代谢流迁移的相关性,菌体变异的定量分析与研究,鸟苷生产菌中嘌呤核苷合成

47、途径三段基因序列的分析,嘌呤核苷生物合成与对应的基因操纵子,对编码肌苷鸟苷生物合成途径中关键酶的基因进行研究： pur操纵子的启动子部分序列（pur操纵子包含嘌呤生物合成途径中有关的12个基因） purA基因（编码AMP支路的sAMP合成酶） guaA基因（编码GMP支路的GMP合成酶） guaB基因（编码GMP支路的IMP脱氢酶） 根据Genebank中已公布的枯草杆菌基因组序列，针对所要研究的四段序列，设计适当的引物合成基因。,生产菌的遗传背景研究,Genebank,关键技术,分别从下列四个菌株中用PCR拉出上述序列：,野生型枯草杆菌（160） 低产型肌苷生产菌7191（161） 目前肌苷

48、生产菌（162） 目前鸟苷生产菌（163）,关键技术,肌苷和鸟苷生产菌在54位（以翻译起始点为1计）缺失了一个A，因此将导致以下的所有序列发生移码突变，所编码的sAMP合成酶失活，致使AMP合成支路受阻，有利于肌苷和鸟苷的积累。这可能是导致生产菌株产苷水平升高的一个重要原因。,研究结果,关键技术,结 论,从鸟苷生产菌的基因比较研究结果，鸟苷生产菌株已具有高产菌的基因结构，而发酵过程中菌体细胞的主流代谢流的迁移是提高生产能力的主要矛盾。,关键技术,确定以代谢流由EMP向HMP途径回复迁移为目标进行过程工艺优化，并以OUR的下降作为跨尺度操作的相关因子 发现调控因子A加入后短期内OUR的下降速度就

49、开始放慢，到48小时开始维持稳定直至放罐，并且发酵后期的糖耗速率也变慢,跨尺度分析与工艺改进,关键技术,代谢流控制,工艺改进前后的酶活时序变化,工艺改进前后的代谢流时序变化,关键技术,创建了全新的补料控制工艺 50L发酵罐： 17.2克/L 32克/L(60小时) 菌体细胞主流代谢流迁移问题是本项目过程优化的关键。,结 果,第十二章 相关发酵设备,1 关于发酵动力学，下列说法不正确的是 A一般来讲，细胞的表观得率小于专一性得率 B对于单级恒化器来说，最重要的特征表示在稳态状态下稀释率与比生长速率相等 C 对于带回流的单级恒化器，其稀释率不能大于临界稀释率 D多级恒化器有助于底物的充分利用和提高

50、细胞产率 2 关于发酵工艺的控制，下列说法正确的是： A一般认为，发酵初期应采用较大的通风和搅拌 B分批发酵过程中，对于溶氧不进行控制，溶氧变化往往出现“波谷”现象，应选择在“谷底”进行补料 C 在溶氧低于临界溶氧浓度时，直接通过调节通风量可达到提高溶氧的目的 D在发酵过程中，控制目标为保持稳定的临界菌体浓度和临界比生长速率，以维持呼吸临界溶氧浓度为前提的耗氧速率与供氧速率的平衡，从而使产物合成速率和比速率达到最大值,具有良好的传质和传热性能,设 备 要 求,结构严密，防杂菌污染,培养基流动与混合性能,良好的检测与控制,设备简单，功耗小,常以溶氧系数的高低及传递1kg氧所耗的功率大小作为衡量发

51、酵罐是否优良的基本指标,一 通风搅拌发酵设备,1、发酵罐的基本条件 发酵罐应具有适宜的径高比。罐身越高，氧的利用率较高。 发酵罐能承受一定的压力。 要保证发酵液必须的溶解氧。 发酵罐应具有足够的冷却面积。 发酵罐内应尽量减少死角，避免藏垢积污，灭菌能彻底，避免染菌。 搅拌器的轴封应严密，防病量减少泄漏。,筒体 电动机与变速装置 搅拌装置 空气分布装置 挡板 检测装置 换热装置 各种接口 消泡装置,2、 结 构,筒体是由圆柱体的罐身和椭圆形或碟形的封头组成，材料为碳钢或不锈钢，对于大型发酵罐可用衬不锈钢板或复合不锈钢制成，衬里用的不锈钢板厚为23毫米。,为了满足工业要求，在一定压力下操作、空消或实消，罐为一个受压容器，通常灭菌的压力为2.5公斤/厘米2（绝对压力）。,（内压）,(封头),（外压）,搅拌装置：通常搅拌器和挡板配合在一起完成传热传质的功能 主要作用：传质、传热和混合 要求：搅拌器的设计应使发酵液有足够的径向流动和适度的轴向流动,搅拌器的叶轮：轴流式和径向叶轮 径向叶轮：叶面平行于搅拌轴、垂直于轴