09-分子病理基础-纲要.ppt

1、1,Department of Pathology School of Basic Medical Sciences Huang Aimin,肿瘤的分子病理学基础,2, 基因结构的分子病理改变 癌基因与抑癌基因 肿瘤分子病理学研究方法,3,基因结构分子病理改变的主要类型, 点突变 在基因编码区缺失或插入几个碱基 基因序列大片断缺失和插入 染色体易位重排 基因扩增 转录调控异常引起mRNA合成异常 转录后及翻译调控异常引起蛋白质异常,4,1 点突变 单个碱基被另一种碱基取代 1) 硷基替换致氨基酸改变 CTCCCC 亮 脯氨酸 2) 终止密码突变,合成比正常长的肽链 TAATAC 终止酪氨酸 3

2、) 突变形成终止密码,肽链变短 TGGTGA 色氨酸终止 4) 密码子改变,氨基酸无改变 TCCTCG 丝氨酸丝氨酸,错义突变 (missense),无义突变 ( nonsense),5,2 在基因编码区缺失或插入几个碱基 缺失或插入3n个碱基,引起n个氨基酸 缺失或插入 TAC TCC ACA GCATAC GCA 酪 丝 苏 丙 酪 丙 插入处往后的氨基酸序列完全改变 (Frame shift, 移码突变) TAC GCA ACATAC AGC AAC A 酪 丙 苏 酪 丝 门冬,6,插入后产生终止密码，肽链变短 CCA AAC GCACCA TAA CGC A 脯 门冬 丙 脯 终止

3、插入后终止密码改变，肽链变长 CTC TA A ACACTC TAC AAC A 亮 终止 亮 酪 门冬,7,3 基因序列大片断缺失和插入 使功能蛋白缺失或产生异常蛋白 视网膜母细胞瘤Rb基因大片断缺失 甲型血友病Exon 14插入2-4 Kb片断,8,5 基因扩增 基因序列拷贝数增多，重复序列增多 转录成mRNA增多 翻译成的蛋白质增多,9,6 转录调控异常引起mRNA合成异常 促进子、增强子或其它基因调控 因子异常，引起转录增多，进而 引起翻译成的蛋白质量增多 乳腺癌Her-2基因促进子异常，使Her-2 转录增多，蛋白质增多,10,7 转录后及翻译调控异常引起蛋白质异常 转录后及翻译调控

4、异常 蛋白修饰改变 蛋白质量和质的异常 功能蛋白或酶的异常可致细胞转化,11, 基因结构的分子病理改变 癌基因与抑癌基因 肿瘤分子病理学研究方法,12,肿瘤发生的分子生物学基础, 原癌基因、癌基因、肿瘤抑制基因 对细胞生长、分化起正向或反向调节 发生异常改变，可致细胞转化和肿瘤发生 肿瘤是细胞中多种基因突变的结果 oncogene tumor suppressor gene DNA repair gene & apoptosis regulatory gene,13,癌 基 因 与 抑 癌 基 因,肿瘤的发生与癌基因的活化及抑癌 基因的失活密切相关 多步骤，涉及多种癌基因和抑癌基因 一种肿瘤可

5、有多种基因的变化 同一种基因的改变可在不同肿瘤的 发生中起作用,14,原癌基因和癌基因的发现和定义,1989年 Varmus 和 Bishop获诺贝尔奖 proto-oncogene 存在于正常细胞内，编码促进细胞生长物质的基因序列，以非激活的形式存在 原癌基因编码的蛋白质多为对正常细胞生长十分重要的GF & GFR,15, 生长因子及生长因子受体 PDGF FGF EGFR c-sis基因产物是与PDGF相似的蛋白质 信号转导蛋白（signal-transducing proteins) H-ras、K-ras和N-ras，均可产生p21蛋白 定位于细胞膜内侧的膜结合蛋白，接收细胞外 生长信

6、号，在细胞增殖和分化中起重要作用,原癌基因的产物和正常功能,16, 细胞周期调节蛋白 CYCD1-细胞周期蛋白 CDK4-细胞周期蛋白依赖性激酶 核调节蛋白 (nuclear regulatory proteins) 转录活化因子 myc、myb、fos 产物为位于细胞核内的蛋白质 启动DNA复制过程，使静止期细胞进入细胞周期,原癌基因产物,18,基因变异方式和原癌基因活化, 点突变-癌基因活化的主要方式 DNA扩增-另一主要方式 不明原因复制成多拷贝( Myc-神经母） 染色体易位与基因重排-淋巴瘤和白血病,19, 癌基因甲基化改变-低甲基化 且与点突变、基因缺失、基因表达异常 发生有密切关

7、系 基因过量表达 不适宜的时间和场合表达 错误地开启在胚胎时期才有活性的基因 细胞癌变的一个重要因素,20,癌基因与人类肿瘤,1 Ras基因变异与肿瘤 H-ras K-ras N-ras 全长约30kb，由4个Exon组成 均可产生分子量为21KD的蛋白质-p21 由189个氨基酸组成 P21具有GTP结合活性，参与信号传递 许多癌基因的转化作用可能由ras信号系统介导，故ras异常与肿瘤增殖密切相关,21,肿瘤中ras改变 基因突变：第12、13、61致瘤性点突变 20肺癌 90胰腺癌 80大肠癌 30前列腺癌 1050白血病 早期胃癌 基因过度表达 乳腺癌、胃癌等均有p21ras蛋白增多,

8、22,2) 基因扩增 基因序列拷贝数增多 神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、 小细胞肺癌、胃癌、乳腺癌等 与肿瘤进展、浸润、预后、复发有关,23,3 c-erbB-2基因-Neu、Her-2 产物185KD (P185), 与EGFR十分相似 肿瘤中-基因扩增与过度表达 引起蛋白增多（免疫组化染色增强） 见于30以上的人类肿瘤 乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌 阳性患者抗肿瘤治疗敏感性低，预后差,24,4 c-abl基因 位于第9号染色体上 肿瘤中abl基因改变，主要表现为基因 重排，与第22号染色体上的Bcr基因片 断形成BCR-ABL融合基因，为费城染色 体(ph)的分子基础 90慢性粒细胞性白血

9、病 20急性淋巴细胞性白血病,25,5 Bcl-2基因 位于第18号染色体 凋亡调节基因，抑制凋亡 Bcl-2基因活化主要由基因重排引起 80滤泡性淋巴瘤 20弥漫性大细胞淋巴瘤 50未分化淋巴瘤,26,6 Fos、sis基因 乳腺癌、肺癌 7 Src、Sas基因 神经母、软组织肉瘤 8 c-Met基因 胃癌 腺样结构 9 Kit基因胃肠道间质瘤,27,抑癌基因是指在发生突变、缺失或失活时可 引起细胞恶性转化而导致肿瘤发生的基因 肿瘤抑制基因 ( tumor suppressor gene ) 其根本作用在于抑制细胞过度增殖 抑制癌基因的活化及表达，或通过使癌基因 表达产物失活，对细胞恶性转化

10、负调节,抑 癌 基 因,28, 抑癌基因失活,突变、缺失等而失活 对细胞生长的负调控作用减弱或消失 细胞过度增生且分化不成熟 恶性转化,Rb, p53, p16, p15, PTEN, BRCA, nm23,判定抑癌基因的3个基本标准, 恶性肿瘤的相应正常组织中该基因须 正常表达 恶性肿瘤中该基因功能失活或结构改变 或表达缺陷 将该基因的野生型导入瘤细胞内, 可部分或全部改变其恶性表型,30,抑癌基因突变的基本病变, Point mutation Gene losses Gene translocation and rearrangement Methylation / hypermethyl

11、ation Lower expression Combine with oncogene protein,31,1 p53基因 人p53基因为约20 kb的DNA片段 位于17号染色体，共有11个外显子, 转录出约为2.5 kb的mRNA 编码393个AA组成的53 KD核内蛋白质 具蛋白质-蛋白质及蛋白质-DNA结合功能 被Science评为1993年的明星分子,常见的抑癌基因与肿瘤,32,p53蛋白有5个高度保守区 AA residuals 13-19 AA residuals 117-142 AA residuals 171-181 AA residuals 234-258 AA res

12、iduals 270-286,33, p53是细胞生长周期中的负调节因子 细胞周期调控 DNA修复 细胞分化 细胞凋亡,34,肿瘤细胞p53基因的改变 1) 点突变或基因小片断缺失或插入 人肿瘤中最常见的突变（5060） 常发生在第58 Exon，突变热点（hotspots),E5,E6,E7,E8,E9,E10,E11,E4,E3,E2,突变相对频率,P53 基 因 组 DNA 结 构,35,Hotspots codon 132-143 codon 174-179 codon 236-248 codon 272-281 肺癌 (273) 结肠癌 (175） 肝癌 (249） 乳腺癌(248-

13、258) 胃癌 膀胱癌 肺癌与肝癌 G T 结 肠 癌 GC AT,36,2) 蛋白的改变 野生型p53蛋白极不稳定，半衰期仅数分钟 难以检出 基因突变表达突变型p53蛋白时，半衰期 增加到数小时, 免疫组化可检出p53蛋白 突变型p53蛋白，无抑癌功能,37,2 Rb基因 第一个被克隆的抑癌基因，最重要 首先在Retinoblastoma中发现，称为Rb基因 1986年美国3个实验室分别独立克隆-200kb 27 Exon，转录产物为4.7kb的mRNA mRNA编码由928 AA组成MW 105-110KD的核内 蛋白，参与细胞周期调控 磷酸化与非磷酸化两种形式,38,Rb基因在肿瘤中的改

14、变主要为大片断缺失 和基因突变 RB抑癌基因的缺失或突变而导致P105失活 视网膜母细胞瘤 骨肉瘤.43% 小细胞肺癌.47% 乳腺癌.32% 与 p53, c-myc, c-fos, TGF相互调节,3 MTS1基因 又称p16或p16CDK4I (Multiple tumor suppressor 1) 4 MTS2基因 又称p15CDK6I 5 CIP1(WAF1)基因编码p21WAF1蛋白 CIP1 (CDK-interacted-protein 1) WAF1 (Wild type p53 activated fragment 1) 6 BRCA1、 BRCA2基因 乳腺卵巢癌易感基

15、因,40,7 APC、DCC基因-抑制信号传导 adenomatous polyposis coli, APC deleted in colorectal carcinoma, DCC 家族性结肠多发性息肉病、结肠癌、胃癌 8 PTEN基因 1997年由三个实验室同时分离鉴定 MMAC-1（mutated in multiple advanced cancer 1),41,9 p63、p73基因 DNA序列上与p53基因有很大同源性 10 WT1基因 肾细胞分化有关 Wilms瘤中基因缺失或变异 11 NF1基因 神经纤维瘤病易感基因, 多步癌变的分子基础,分子水平改变,正常上皮,过度增生,形

16、态学改变,早期腺瘤,晚期腺瘤,结肠癌,APC缺失或突变,中期腺瘤,DNA甲基化丧失,Ras基因突变,DCC基因缺失,P53基因缺失,43,肿瘤分子病理诊断的意义 肿瘤易感基因病变的诊断 肿瘤的早期诊断与鉴别诊断 疑难肿瘤的诊断及分类 肿瘤病情监测 肿瘤的个体化和预见性治疗 肿瘤的预后判断,44, 肿瘤易感基因病变的诊断,与遗传相关的肿瘤易感基因检测，筛检肿瘤高危人群 已明确的肿瘤易感基因及其相关肿瘤 Rb-视网膜母细胞瘤 WT1-肾母细胞瘤 APC-家族性腺瘤性息肉病 NF1-神经纤维瘤病 BRCA1、2、3-乳腺癌,45, 肿瘤基因标志与肿瘤诊断 较普遍表达 H-ras K-ras c-my

17、c c-fos 特异性表达 abl 临床诊断意义尚不明确 c-mos c-yes c-fps c-src,46, 肿瘤的早期诊断,分子病理改变早于细胞形态学改变 可能检测出浸润前期的肿瘤 K-ras基因突变-12, 13, 61 胰腺癌、结肠癌、肺癌 FNA检测胰腺癌第12密码子突变， 检出率100 P53蛋白的核内表达为多种恶性肿瘤的表现,47,肿瘤基因标志与肿瘤鉴别诊断 erbB：上皮源性肿瘤高表达 erbB：肺大细胞癌高表达 肺小细胞癌及黑色素瘤低或不表达 Fms ：粒细胞性白血病高表达 淋巴细胞性白血病不表达 C-myc激活.B细胞性淋巴瘤 L-myc扩增.肺小细胞癌 N-myc扩增.

18、神经母细胞瘤,48, 疑难肿瘤的诊断及分类,判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤及其克隆起源 RFLP和PCR分析Ig或T细胞受体（TCR)基因的重排 B细胞性淋巴瘤-Ig 、 、重链（H)重排 T细胞性淋巴瘤-TCR基因重排 慢性粒细胞性白血病-Bcr区基因重排 神经母细胞瘤-N-myc扩增与过表达 神经细胞瘤-C-myc扩增与过表达,49,肿瘤的病情监测 N-myc高表达.神经母恶性进展 L-myc活性高.肺小细胞癌恶性度高 ras高表达前列腺癌低分化 H-ras高表达胃癌已转移 neu高表达.癌已转移，存活期短 （乳腺癌及卵巢癌）,50, 肿瘤的个体化和预见性治疗 反义治疗 人工合成特异寡核

19、苷酸导入瘤细胞，封闭致癌基因的表达 myc myb fos ki-ras H-ras abl-bcr,51,抑癌基因治疗 将正常的抑癌基因导入恶变细胞内 代替或补偿有缺陷的抑癌基因，抑制肿瘤生长并逆转其表型 已有报道将 RBP53 APC NF1 P21 P16 分别导入多种肿瘤细胞内,52, 肿瘤的预后判断,P53 p16 c-erbB-2 乳腺癌、肝癌、结肠癌的预后相关 nm23-肿瘤转移抑制基因,53, 基因结构的分子病理改变 癌基因与抑癌基因 肿瘤分子病理学研究方法,54,病理学发展的崭新变革 对疾病的认识由表型向基因型过渡 传统的以形态学为主“旧生物学” 病理诊断主要依从于经验 “新

20、生物学”+循证病理学 功能基因组学和蛋白组学为技术平台,55,基因多态性检测 基因表达谱分析 蛋白表达谱分析 生物芯片 生物信息学bioinformatics 成千上万个数据及其相互关联评价 分子生物学与病理形态学的整合,56,肿瘤病理发生学 分子诊断和分型，新病种 疾病的微生物检测和诊断 疾病进展和预后的评估 药物反应，指导个体化治疗 增加病理学诊断的准确性和权威性 实验室研究逐步进入临床应用阶段,应 用,基因芯片技术（gene chip/DNA chip） 1995年Standford大学医学中心生化系 Brown教授首先报道 大量靶基因或寡核苷酸片断有序高密度 排列在载体上硅片、玻片、尼

21、龙膜 芯片阵列仪 激光扫描仪 计算机 生物信息软件处理系统,1 基因表达谱分析与肿瘤分子分型,P525,58,表达谱基因芯片 基因功能的研究 诊断芯片 检测芯片 遗传病/代谢病/某些肿瘤的诊断 病原微生物检测,59,大规模基因表达谱分析 （large scale gene expression profiling) 基因突变检测、新基因寻找 抗生素和抗肿瘤药物的筛选 疾病的诊断,应 用,60,为肿瘤的精确分型带来希望 基因表达谱作为特征性“分子标签”（molecular signature) 建立全新的肿瘤分子诊断和分型系统 淋巴瘤、白血病、乳腺癌、肺癌分型,61,实验材料要求 新鲜组织或培养

22、细胞中提取的mRNA 外周血和培养细胞样本的研究较容易 对实体瘤的研究受到一定限制,组织微阵列 (tissue microarray, TMA) 1998年Kononen首次提出Nature Medicine 数十至数百个小组织排列于载体上 形成的微缩组织切片 组织筛选和定位 阵列蜡块制作和切片,2 组织芯片技术,63,体积小，信息量大，可根据要求进行组合 高效快速低消耗地进行各种原位组织学 观察研究 形态学、免疫组化、原位杂交、原位PCR 较好的内对照及实验条件可比性和重复性,64,单独或与基因芯片配套用于基因及其 蛋白产物的分析和基因功能的研究 基因探针的筛选及生物制剂的鉴定 组织学、病理

23、学实习教材 外科病理缩微图谱, 直接法-荧光素直接标记已知的DNA探针 间接法-非荧光标记物标记已知探针 桥连一个荧光标记的抗体 DNA-DNA杂交 DNA-RNA杂交 间期细胞 分裂中期染色体 冷冻切片 石蜡切片,3 荧光原位杂交-Fluorescence ISH, FISH,66,重复序列探针 位点特异性探针 全染色体探针 大量商品化的荧光标记探针 FISH广泛应用成为可能,67, FDA批准FISH检测HER2 /c-erbB2 实验目的 评价预后 基于阿霉素的化疗选择 帮助评价是否采取曲妥珠单抗 (Herceptin ,赫赛汀）治疗 IHC 2+ /3+患者，仅FISH阳性者 对药物有

24、反应,68, FISH的应用 乳腺癌HER2基因诊断 肺癌EGFR和HER2基因诊断 膀胱癌无创性早期诊断和复发的早期检测 胃癌、肝癌、胰腺癌、白血病等肿瘤基因的分析研究,2001年12月31日, 美国FDA批准FISH检测HER2 基因状态用于乳腺癌诊断, 以指导临床治疗,HER2基因为红色荧光，正常HER2拷贝数(15) CEP17为17号染色体着丝粒, 为绿色荧光,常规PCR是基因检测的金标准 基因突变检测、测序的前期和基础 易受污染妨碍其临床应用,4 即时荧光定量PCR-Real-time PCR,71,Real-time PCR 灵敏、定量、特异、封闭无污染 提供了对PCR产物积累过

25、程实时监测 微生物病原检测、肿瘤生物学标志物 临床应用前景宽广 将逐渐成为病理学必备技术之一,comparative genomic hybridization, CGH 分子细胞遗传学技术 单一的一次杂交检测某一肿瘤整个基因组的染色体拷贝数量的变化,5 比较基因组杂交,73,CGH的优点,实验所需样本DNA量较少 外周血、培养细胞、新鲜组织、存档组织 全基因组范围内分析肿瘤染色体不平衡 发现癌基因和抑癌基因所在区域 肿瘤发病的分子机制研究,74,CGH的局限性,所能检测到的最小的DNA扩增或丢失在3-5Mb，对于低水平的DNA扩增和小片断丢失可能漏检 相关染色体拷贝数无变化时，不能检测出平行

26、染色体的易位,laser capture microdissection，LCM 从组织切片或细胞涂片上的任一区域 切割数百、数十、单个细胞 再进行PCR、PCR-SSCP、CGH等 冷冻切片、石蜡切片、细胞涂片 先常规或免疫组化染色进行定位,6 激光捕获显微切割术,76,局限性,手工操作技术难度大 LCM操作简便，耗时少，取材准确 需特殊设备，激光器造价高,Laser scanning confocal microscope -LSCM 光学显微镜激光扫描计算机图像处理 细胞CT，显微CT，三维图像重建 活细胞长时间无损伤动态观察 原位-动态-定量,7 激光扫描共聚焦显微术,78,细胞间通讯

27、，膜流动性测定 细胞骨架的构成 培养细胞样本，冷冻切片 石蜡包埋标本不合适 免疫荧光染色或FISH,精密、准确、快速、分辨高 快速准确测定细胞内DNA含量和倍体数 快速进行细胞分选和细胞收集 测定生长分数，诊断恶性肿瘤的参考 反映恶性程度和生物学行为,8 流式细胞术-Flow cytometry，FCM,80,在基础研究和临床中的应用,外周血细胞的免疫表型测定和定量分析 某一特定细胞群的筛选和收集 细胞MDR基因的检测 细胞凋亡的定量研究 癌基因和抑癌基因的检测 细胞内某些蛋白质与核酸的定量分析,81,定量 核形态参数的测定 直径/周长/面积/体积 区别良恶性肿瘤、癌前病变与癌 肿瘤的组织病理

28、分级、预后判断 DNA倍体分析和显色反应的定量 免疫组化 原位杂交,9 图像分析技术-Image analysis ，IA,82, 杂合性缺失（LOH）检测 单核苷酸多态性（SNP) 分析 RNA干扰,83, 核酸杂交 Southern杂交-检测DNA Northern杂交-检测RNA Dot/Slot杂交-检测DNA或RNA 原位杂交 (In situ hybridization, ISH) 应用范围广 DNA和mRNA定性、定位、定量、分布 杂交电镜的亚细胞定位,10 其他常用技术,84, restriction fragment length polymorphism, RFLP 分析 限制性内切酶片断长度多态性分析 Genomic DNA 酶切 电泳 转膜 杂交 放射自显影 分析基因的变化 结合PCR-PCR-RFLP 简便快速样本用量少,85,限制性内切酶酶切位点 EcoRI G AATT CBamH1 G GATC C C TTAA G C CTAG G GTTAGAATTCGAATCCGAGGTTGGATCCCGG CAATCTTAAGCTTAGGCTCCAACCTAGGGCC, Western Blot PCR技术 PCR-RFLP分析 PCR-S