免疫组化实验方法.ppt

1、免疫组化实验方法,免疫组织化学的概念,利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学,2,最突出的优点,在更广阔的范围内，把结构与功能及代谢结合起来，在微观世界原位地确定组织及细胞结构的化学成分，达到方法统一，定性可靠，定位准确，定量可能,3,免疫组化实验标本,组织标本（石蜡切片和冰冻切片） 细胞标本（组织印片、细胞爬片和细胞涂片）。 石蜡切片对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档,4,细胞和组织的固定,1固定的作用-使细

2、胞内蛋白质凝固、终止或抑制外源性和内源性酶活性，最大限度地保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。 2选择最佳固定液的标准：保持组织形态结构；保存抗原性。 （1）醛类固定剂：穿透性较强，收缩性小，是常用的固定剂。如10中性福尔马林液、4多聚甲醛缓冲液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液等。 （2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚甲醛混合使用。 （3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 3常用的固定方法-浸入法和灌注法（

3、适用于动物实验研究） 组织新鲜 勿干燥 体积适中 固定液足够（20倍,5,抗体,常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。 特性比较： 均一性 2. 稳定性 3. 特异性 4. 重复性 5. 沉淀反应,6,荧光素标记抗体,能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素。必备条件: 荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。 结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响，用于活体内标记，结合物应无毒，附加抗原性小,7,常用的染色方法,根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法 按标记物定位于抗原所在部位的手段，则可将免疫细胞组织化学染色方法分为直接法（一步法）、间接法

4、（二步法）、桥连法等。每进行一步结合反应。都会产生一次阳性结果的放大效应。敏感性由高到低依次为桥连法、间接法、直接法,8,染色的基本程序,标记抗体与标本中抗原反应结合； 用缓冲液洗去未结合的成分； 直接观察结果；或显色后再用显微镜观察,9,反应条件,抗原抗体结合属于可逆性反应，具有共性的反应条件： （1）PH：中性及弱硷性条件（PH 78）有利于免疫复合物的形成 （2）离子强度：0.010.02 M的低离于强度有利于免疫复合物的形成 （3）去污剂：有利于复合物的形成，常用的非离子型去污剂有吐温-20，EDTA（0.01%），Triton X-100（0.11%） （4）抗体稀释液中蛋白质浓度：

5、稀释液中含无关蛋白质可以减少抗体的非特异吸附，常用牛血清白蛋白 （5）防腐剂：微生物生长会干扰抗原抗体反应，稀释液和抗体液中加入适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐 （6）温度和时间：较高的反应温度（37）可加速抗原抗体结合反应，低温有利于抗原抗体结合率的提高 （7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇,10,荧光素,1，异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC）黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，最大吸收光谱为490495 nm，最大发射光谱为520530 nm，呈现明亮的黄绿色荧光。

6、最常用。 2四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyante，TRITC）紫红色粉未，较稳定，最大吸收光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明。 3四乙基罗丹明（tetraethylrhodamine B 200，RB200）褐红色粉未，最大吸收光谱570 nm，最大发射光谱596600nm，呈橙红色荧光。价廉,11,染色注意事项,1）在湿盒内进行，以免标本上的试剂干燥。 （2）酸碱度以接近体液环境为宜（PH 7.4左右） （3）组织细胞要求新鲜，最好使用冷冻切片，固定存档标本要求组织结构完好。 （4）切

7、片经染色后，应及时观察并照相。切片在4冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30。 （5）调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验摸索，找出最佳稀释度。 （6）所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻融次数,12,酶标抗体法,通过共价键将酶结合在抗体上制成酶标抗体，再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物，于显微镜下进行细胞或组织表面或内部某种抗原成分定位观察。 常用的酶-辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。 优点：与免疫荧光技术相比，终产物可在普通光镜下观察，切片能够长久保存，经锇酸处理后，电子密度增强，可用

8、于电镜观察,13,抗生物素-生物素-过氧化物酶技术(avidin-biotin peroxidase complex ABC,原理：利用抗生物素分别连接生物素标记的第2抗体和生物素标记的酶。其第1抗体不为标记物所标记，生物素标记的第2抗体与ABC复合物相连接。ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素-过氧化物酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的。常用： ABC-HRP 辣根过氧化物酶：最通用的系统，使用范围广 ABC-AP 碱性磷酸酶：灵敏度比较高，染色密度较低 ABC-GO 葡萄糖氧化酶：灵敏度较低，适用于组织内源性HRP或者AP含量比较高的组织，常与HRP或者AP系统配合进

9、行双染,14,15,16,ABC法的特点： 敏感性强 特异性强，背景染色淡 方法简便，节约时间 可用于双重或多重免疫染色,17,免疫金染色原理：免疫金染色技术使用胶体金耦联抗体，然后在光学显微镜下检测抗原。 解决了免疫组化里内源性酶干扰的问题。 整个检测过程中无需酶的参与，因此不必预先处理样本以消除内源性酶的活性,免疫组化试剂的正确选择和使用,18,一抗 1. 首选单克隆抗体：单克隆抗体具有高特异性、高亲和力、交叉反应少等特点，避免与细胞或组织蛋白的非特异性结合，减少染色背景。 2. 多克隆抗体：最好是经样本来源种属正常血清吸附过，尽可能的减少非特异性着色背景。加一抗前，用封闭液（可以是BSA

10、或二抗来源的正常动物血清）充分封闭，以阻断非特异性结合位点。 3. 跨膜分子的抗体选择：要注意免疫原是整个蛋白分子或是胞外区、胞内区。对于胞内区抗体，染色时需要使用穿孔剂，而胞外区抗体不必使用。 4. 正确使用：一般供应商都会提供稀释范围和使用方法。但常常需要重新选择比例。一般从供应商提供稀释比例的1/10稀释度始，作倍比稀释,19,20,二抗 种属来源要匹配：根据所用一抗选定二抗。一般来说，如果一抗是小鼠原性，二抗应选择兔/山羊或其它种属抗小鼠的抗体。 注意抗体同种型和亚型：确定一抗同种型和亚型后，可以选择抗一抗来源种属广谱Ig或针对一抗亚型的二抗。如一抗是小鼠IgG1, 可以选用山羊抗小鼠的Ig或IgG1的二抗。 正确使用：也需要重新选择稀释比例。一般从供应商提供稀释比例的1/10稀释度始，作5倍比稀释,21,设立阳性对照和阴性对照 -证明实验系统的正确性 1. 阳性对照：主要涉及所用缓冲液、稀释液、二抗和检测系统等因素。尤其在结果出现无信号时，为查找原因提供重要线索。 2. 阴性对照：一种是自身对照（常用），指测试组织本身非抗原表达部位。一种是外部对照，指已证实不表达检测抗原的组织,22,试剂保存-抗体试剂保存： 抗体浓度越高越稳定，易保存；