分子诊断学：第七章 Sanger测序及高通量测序技术

1、临床基因组学第七章 Sanger测序及高通量测序技术,临床基因组学 第七章主要内容,第一节 核酸测序技术的发展 第二节 Sanger测序技术 第三节 高通量测序技术及其应用,教学目的,1. 了解高通量测序结果分析的流程 2. 掌握常见的基因突变的类型 3. 熟悉常用的人群基因变异数据库 4. 了解常用的基因变异分析软件 5. 了解高通量测序技术的临床应用,高通量测序结果分析,从头测序（de novo sequencing） 对基因组序列未知或没有近源物种基因组信息的某个物种，对其不同长度基因组DNA片段及其文库进行序列测定，然后用生物信息学方法进行拼接、组装和注释，从而获得该物种完整的基因组序

2、列图谱。 重测序（re-sequencing） 全基因组重测序是对已知参考基因组序列的物种进行不同个体间的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。通过全基因组重测序，研究人员可以找到大量的单核苷酸多态性位点（SNP）、拷贝数变异（Copy Number Variation, CNV）、插入缺失（InDel）、结构变异（Structure Variation, SV）等变异信息,高通量测序结果分析的流程,分析的起点：化学信号、荧光信号或者电流信号 原始信号转为序列信号：产生大量的reads，带有质量、位置参数 质量控制：设定一个质量门槛，排除质量差的reads或者部分序列 从头测序

3、序列拼接、组装、注释 重测序 序列比对：将一个个质量合格的reads比对到参考序列 突变识别：通过比对，找出测序结果中与参考序列不一致的序列，并且用一套命名方法进行命名 基因突变的注释,高通量测序结果分析的流程（从头测序）,高通量测序结果分析的流程（重测序）,出自：ACMG guideline (2015),高通量测序技术可检测的范围,B,A,D,C,序列比对 bcl2fastq：将测序下机数据按样本分割并转为fastq格式 bwa：将测序数据比对到人类参考基因组上 samtools/picard：整理比对结果、标记duplicate等,分析流程,B,A,D,C,数据库分析 GATK：call

4、 SNV/indel annovar：对突变位点进行注释，例如突变在人群中的频率（千人基因组、ESP6500和dbSNP）、有无文献报道致病（HGMD）等 错义突变分析：PolyPhen2; SIFT等等 剪接改变的分析：NetGene2 Server; AUGUSTUS等,分析流程,B,A,D,C,文献阅读 病例报告or功能研究 必要时查阅多篇文献,分析流程,B,A,D,C,完成报告 视情况对先证者的突变位点进行Sanger测序，同时对先证者家属标本进行验证 撰写报告，审核并签发,分析流程,基因突变的注释,检测到的变异需进一步进行注释，以确定其生物学意义，进行下游的分析和功能研究。 这部分主

5、要是结合多种生物注释数据库综合分析，包括频率、结构、预测及突变数据库，每种注释方法都有其优缺点，故分析时需综合各数据库的结果判断。,常用的基因变异注释分析资源,千人基因组计划（1000 Genomes Project, 1000G） 国际千人基因组计划主要由中国、英国、美国等多个国际协作完成。 2012年，自然杂志报道了1092个人类基因组序列。 NHLBI Cohort (ESP6500) NHLBI美国国家心脏、肺、血液研究所 6503个样本： 2203 African-Americans 4300 European-Americans,基因结构简图,基因变异类型与命名,http:/www

6、./mutnomen/recs-prot.html,替代变异（substitutions） 外显子区：c.203TC 内含子区：c.89-1GT 缺失变异（deletion） c.450delT c.25_27delTCA 重复突变（duplications） c.7_8dupAT 插入突变（insertions） c.112_117indelsTG,DNA水平命名,蛋白质水平,错义突变 p.Trp26Cys 同义变异 c.162CG（p.=） 起始密码子(Met1)变异： P.Met1？ 缺失变异（deletions） p.Gln8del p.Gly4_Gln6del 重复突

7、变（duplications） p.Gln8dup p.Gly4_Gln6dup,无义突变 P.Trp26X 插入变异（insertions） p.Lys2_Leu3insGlnSer 插入/缺失变异（indels） p.Cys28_Lys29indelsTrp 框移变异（frame shifts） p.Arg97fs 插入变异（insertions） p.Gly4_Gln6dup,Polyphen蛋白预测,结果分析,剪接预测相关网站及使用,网站 /SplicingAnalyser.html http:/www.cbs.dtu.dk/ser

8、vices/NetGene2/,http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/,在CBS网站，正常序列结果如下： Donor：350 confidence：0.76 说明剪接位点在350处,序列为atcaggtaggac,基因变异临床解释指南： 美国遗传学与基因组学学会指南,基因突变/变异,Pathogenic（病理性的） Likely pathogenic （可疑病理性的） Uncertain significance (VUS)（意义未明的） Likely benign（可能良性的） Benign（良性的） 良性的或者不清楚的用“变异”,良性 / 非致病性,

9、Increased segregation data,病理性,对应报告单中的“阳性”,对应报告单中的“可疑阳性”,测序结果解读,测序结果解读,对应报告单中的“阴性”,对应报告单中的“未知意义”,案例：SCN1A杂合变异,患者：2岁，症状较轻，有热性惊厥，无咖啡牛奶斑 突变：p.Ala1262Val 问题：该突变未见有报道,证据4：PP3 Polyphen-2：疑似影响功能,证据1：PS2 家系分析：发现患者的突变为新发突变,证据2：PM2 未见报道，正常人数据库少见,证据3：PP2 SCN1A基因的致病突变中，错义突变相当常见； 错义突变中，很大比例是已知的致病的。 ClinVar datab

10、ase: 773种SCN1A变异被收录，其中错义变异533种: Benign/likely benign: 5 Path./likely path.: 289 Conflicting: 1 VUS: 112 Not provided: 120,结论：,Likely Pathogenic,基因测序技术的临床应用,筛选疾病候选基因 遗传病的临床诊断 肿瘤检测中的应用 无创性产前诊断,3岁9个月，男患儿 肺炎；支原体感染； 大头畸形，眼窝深陷，睑裂长，鼻梁低平，鸡胸，脐疝，爪形手，胎痣，肝大，右肾囊状影 粘多糖症？ 父母近亲结婚 无家族史,案例分享C,实例分析,一、测序数据初步分析,IDUA chr

11、4: 995865_995874 c.888_897del p.Tyr296*,IDUA基因,IDUA基因与粘多糖病1型相关，出生时无明显症状，可能有脐疝或腹股沟疝，1岁内开始出现症状，表现为脑积水引起大头，心瓣膜异常，面容异常（粗），肝脾肿大，进行性发育迟缓，体矮，智力低下，胸廊畸形,结论：阳性，检测到符合临床情况的致病变异,IDUA c.888_897del p.Tyr296* 纯合 病理性变异 该变异在cDNA水平引起一段9个碱基的缺失，在蛋白水平引起第296位Tyr密码子变异为翻译的终止信号，使得所编码的蛋白被截断从而影响生物学功能。该变异尚未见报道，也并非已知的SNP位点。IDUA基

12、因的失功能型的变异被认为与粘多糖症有关。 综合考虑，该变异为病理性变异。 解释： 检测到该受检者的IDUA基因的一个纯合的病理性变异，该变异可引起粘多糖症1型，遗传方式为常染色体隐性遗传。 患者的父母亲均为携带者，每次生育子女有25%的患病风险。,基因测序技术的临床应用,筛选疾病候选基因 遗传病的临床诊断 肿瘤检测中的应用 无创性产前诊断,前段时间著名影星Angelina Jolie自爆已接受预防性双侧乳腺切除术，因为她本人罹患乳腺癌的风险极高。 38岁的美国女星Angelina Jolie在纽约时报上发表了我的医疗选择一文，称由于自己携带有 BRCA1基因，医生估计她患上乳腺癌的风险高达87

13、%，患上卵巢癌的风险高达50%，她母亲在56岁时死于癌症。朱莉说切除术后，她患上乳腺癌的风险已降至5%。 日后，有与安吉丽娜朱莉同样担忧的女性就可以借助 NGS技术进行BRCA检测，提早采取相关措施。,基因测序技术的临床应用,筛选疾病候选基因 遗传病的临床诊断 肿瘤检测中的应用 无创性产前诊断,在产前诊断方面（ prenatal diagnosis），以新一代测序技术为依托的创新检测手段也将会彻底改变传统的诊疗模式。 目前非侵入式的产前检测手段（non invasive prenatal test），能够诊断21三体综合症（trisomy 21）。只需要抽取孕妇一点点血液，检测其中微量的胎儿21号染色体就够了。这种非侵入式的产前检测手段，以及类似的检测13三体或者18三体综合症的检测手段都具有非常高的敏感度和特异性，一定能够在产前检查领域里找到自己的位置,临床应用规范与要求,与常规的基因检测技术相同的要求 由于技术特点带来的特殊要求 大量的生物信息学处理过程 检测技术的局限性,高通量测序临床应用的质量控制规范起草机构,美国医