液相色谱柱的选择

1、液相色谱柱的选择,卢志浩,奥秘科技有限公司,luzhaumigrp,客,服,0531-8856-3956,2019,年,11,月,12,月,山东,影响,C18,色谱柱性能的主要因素,色谱柱与色谱填料的特性,1,柱填料,硅胶纯度,粒径,比表面积,孔径,2,色谱柱的构型,色谱柱直径,色谱柱长度,3,固定相,键合类型,残余硅羟基的影响,反相键合相的保留行为,键合硅胶的稳定性,物理因素,化学因素,柱填料对色谱柱性能的影响,柱填料对,C18,色谱柱性能的影响：硅胶纯度,I,2.3,二羟基萘,OH,OH,O,H,O,H,2.7,二羟基萘,min,0,1,2,3,4,5,6,7,mAU,0,10,20,30

2、,40,VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07091702.D,3,0,0,8,4,0,8,4,min,0,1,2,3,4,5,6,mAU,0,10,20,30,40,50,VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07090605.D,A,e,a,2,5,3,2,8,8,2,2,7,5,A,e,a,4,0,0,3,9,9,2,8,8,9,min,0,1,2,3,4,5,6,7,mAU,0,5,10,15,20,25,30,35,40,VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07091208.D,2,4,5,0,3,4,7,1,m

3、in,0,2,4,6,8,10,mAU,5,10,15,20,25,VWD1 A, Wavelength=230 nm (LPF07091202.D,3,9,4,4,A,e,a,1,7,6,6,8,6,5,9,3,4,TF=1.31,Brand W, AQ Column 5,m, 4.6mm,150mm,Brand Z,C18 Column 5,m, 4.6mm,150mm,baulo C18 5,m, 4.6mm,150mm,Brand H, C18 Column 5,m, 4.6mm,150mm,min,0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,mAU,0,10,20,30,40,VWD1

4、A, Wavelength=230 nm (LPF07091711.D,2,8,9,9,Brand U,C18 Column 5,m, 4.6mm,150mm,TF=1.42,TF=1.39,TF=1.69,TF,流动相,甲醇：水,65,35,流速,1 mL/min,温度,35,检测波长,230 nm,进样量,20 L,硅胶纯度金属含量,柱填料对,C18,色谱柱性能的影响：硅胶纯度,II,硅胶纯度金属含量,d,柱填料对,C18,色谱柱性能的影响：粒径,硅胶粒径和类型对柱效的影响,d,硅胶粒径和类型对压力的影响,柱填料对,C18,色谱柱性能的影响：粒径,II,目前市场主要可供选择的填料粒径,1.

5、7,m,1.8,m,2.2,m,快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪,2.7,m,多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离,Halo,3.0,m,3.5,m,普通快速分析,5.0,m,常规分析,颗粒越小，柱效越高,但是耐污染性能下降，柱压升高,柱填料对,C18,色谱柱性能的影响：比表面积,每克填料的表面积，与粒度，孔径有关,比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间,增加,梯度洗脱尤为注意,根据需要选择合适的比表面积,柱填料对,C18,色谱柱性能的影响：孔径,I,多孔材料的,95,以上表面,在孔内部,样品分子直径小于平均孔,径，才能进入微粒内部,孔径至少是样品流体学直,径的,4,倍,300,孔径用于

6、：超过,50,个,氨基酸的肽或,25,个残基的低,聚寡核苷酸,样品分子直径小于平均孔径,才能进入微粒内部,柱填料对,C18,色谱柱性能的影响：孔径,II,小生物分子的保留值在小孔径填料通常更大,条件,C8,色谱柱,4.6,150mm,3.5um,A,溶剂,0.1%TFA,水溶液,B,溶剂,0.1%TFA,于,80,乙腈,水中,20min,梯度,10,30%B,60,C,1.5ml/min,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响,色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径,色谱柱尺寸,对色谱分离的影响,短柱,15-100mm),运行时间短,柱压低,长柱,150-250mm),分辨率高,运行时间长,窄径柱

7、,2.1mm),检测器灵敏度高,宽径柱,3-21.2mm),载样量高,固定相对色谱柱性能的影响,固定相对色谱柱性能的影响：键合类型,A,纵向交联,保留和选择不稳定,B,横向交联,宽,pH,适用,C,单体键合,重现性好，柱效高,D,单体（空间保护,低,pH,稳定,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,残余硅羟基的影响,普通硅胶,当流动相的,pH,值大于,4.5-5.0,时，表面的硅羟,基会带负电荷，碱性化合物拖尾,解决方法,封尾,双层表面修饰,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,封尾,键合填料与小硅烷进行后续反应，如三,甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基,以增加表面覆盖率,缺点,不能

8、完全反应（仍有,50,的硅羟基未被,反应,在,pH3,时,TMS,易流失，耐用性，稳定,性不好,TMS,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,不同长度和体积的键合相对表面覆盖率的影响,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,S,i,O,S,i,O,S,i,O,S,i,O,S,i,O,S,i,O,H,O,O,O,O,O,O,O,H,O,O,S,i,O,S,i,S,i,O,S,i,O,O,O,O,H,H,O,O,O,S,i,S,i,O,O,O,H,S,i,S,i,S,i,S,i,O,O,O,O,C,H,3,C,H,3,C,H,3,C,H,3,S,i,O,S,i,O,S,i,O,S,i,O

9、,S,i,O,S,i,O,O,O,O,O,O,S,i,O,S,i,O,O,O,S,i,O,S,i,S,i,O,S,i,O,O,O,O,O,O,O,S,i,S,i,O,O,O,S,i,H,H,S,i,O,O,O,C,H,3,C,H,3,C,H,3,S,i,O,O,O,C,H,3,C,H,3,C,H,3,S,i,O,O,O,C,H,3,C,H,3,C,H,3,S,i,O,S,i,O,S,i,O,S,i,O,S,i,O,S,i,O,O,O,O,O,O,O,S,i,O,O,O,S,i,O,S,i,S,i,O,S,i,O,O,O,O,O,O,O,S,i,S,i,O,O,O,S,i,H,H,S,i,S,i

10、,O,H,O,H,O,H,S,i,O,H,O,H,O,H,S,i,O,H,O,H,O,H,S,i,O,S,i,O,S,i,O,S,i,O,S,i,O,S,i,O,O,O,O,O,O,O,O,O,O,S,i,O,S,i,S,i,O,S,i,O,O,O,O,O,O,O,S,i,S,i,O,O,O,S,i,H,H,S,i,S,i,S,i,O,H,O,H,S,i,O,H,O,H,S,i,O,H,O,H,R,S,i,C,H,3,2,X,C,H,3,2,S,i,R,C,H,3,2,S,i,R,C,H,3,2,S,i,R,H,y,d,r,o,ly,s,is,双层表面修饰,降低表面硅羟基活性，硅胶表面更加均匀

11、,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,硅胶双层表面修饰后,新增加表面层硅羟基活性更低新硅羟基,pH=5.2,普通硅,羟基,pH,约为,3.5,更对称的峰型,硅胶表面更均匀硅胶微晶形成过程中的不光滑表面被覆盖,重现性更好,表面纯度更高硅胶金属杂质被覆盖,极性化合物保留和分离更好,固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基的影响,双层表面修饰,代表产品,StableBond C18,PolarBond C18,SurfBond C18,0.01 ng/mL Pseudoephedrine,AUMI Baulo StableBond,2.1,50mm, 5,m,Brand A C18,2.1,50

12、mm, 5,m,Phenomenex Luna C18,2.0,50mm, 5,m,固定相对色谱柱性能的影响：反相键合相的保留行为,同一厂家相同硅胶基质的反相柱,保留值随含碳量的增加而增加,比表面积越大，保留值越大,键合碳链越长，保留越大,C18,C8C3C1,长链之间差别不大,固定相对色谱柱性能的影响：反相键合相的保留行为,不同厂家色谱柱的,保留值，选择性与峰型,色谱柱,4.6*150mm,流动相：乙腈,0.05M,磷酸钾缓冲液,pH3.2(65:35,流速,1ml/min,拖尾峰,T,0,尿嘧啶,P,吡啶,L,苯酚,N,N,N,二甲基苯胺,B,4,丁基苯甲酸,J,甲苯,固定相对色谱柱性能的影响,键合硅胶的稳定性,键合硅胶的稳定性,低,pH,值，键合相流失,高,pH,值，硅胶溶解,影响色谱柱寿命，方法不重现,固定相对色谱柱性能的影响,键合硅胶的稳定性,低,pH,值，键合相流失,固定相对色谱柱性能的影响,键合硅胶的稳定性,空间位阻保护，延缓键合相流失,固定相对色谱柱性能的影响,键合硅胶的稳定性,高,pH,值，硅胶基质溶解,pH9,时，色谱柱的稳定性,固定相对色谱柱性能的影响,键合硅胶的稳定性,碳杂化，延硅胶缓高,pH,值水解,表面碳杂化示意图,奥秘为您提供全面的,LC,解决方案,2019,版药典,LC,方法开发服务,全面的色谱柱选择,高比表面积,Bau