植物组织培养基本操作

1、2植物组织培养基本操作,目的与要求 了解植物组织培养的培养基种类、成分及其特点，学习植物组织培养基本操作，了解离体培养环境条件，以及炼苗移栽基本方法。 具有植物组织培养基本操作程序的认知。能够识别各类培养基特点，熟悉MS培养基成分；具有制作培养基能力，具有选择外植体、表面灭菌、无菌接种等基本能力；具有植物组织培养条件控制基本能力；有进行组培苗驯化练苗的基本能力,第一节 培养基成分、种类及特点 第二节 培养基的制备 第三节 外植体无菌接种 第四节 外植体培养 第五节 试管苗的驯化与移栽,组织培养步骤图,1）准备阶段 查阅相关文献，根据已成功培养的相近植物资料，结合实际制定出切实可行的培养方案。

2、根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基，并经高压灭菌或过滤除菌后备用。 （2）外植体的选择与消毒 选择合适的部位作为外植体，采回后经过处理，然后进行消毒处理。 将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块，或剥离出茎尖、挑出花药，接种到启动培养基上,3）启动培养 接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，促使外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋芽直接萌发形成芽。 将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原基或形成胚状体，最后发育形成再生植株。 （4）增殖培养 分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的增殖培养基经反复多次切割转接。 当芽苗繁殖到一定数量后

3、，再将一部分用于壮苗生根，另一部分保存或继续扩繁。进行脱毒苗培养的还要进行病毒检测,5）生根培养 刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降低或不加细胞分裂素浓度，提高生长素浓度，促进芽苗生根，提高其健壮度。 （6）炼苗移栽 选择生长健壮，有35条根的生根苗进行炼苗，移栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮荫。当苗完全成活后，再移向大田,拟定培养方案,外植体预处理,外植体无菌接种,启动培养,分化出芽、胚状体或原球茎,继代增殖培养,生根培养,炼苗移栽,成活供生产使用,植物组织培养的一般程序,培养基配制灭菌,第一节培养基成分、种类及特点 植物生长必需16种基本元素： N、P、K、Ca、Mg、S

4、、Fe、Mn、B、Cu、Zn、Mo、Cl、C、H、O。 离体培养条件下，各元素主要从培养基中获得： H和O来源于水，C来源于添加的糖类，其它矿质元素来源于组成培养基的无机盐。 培养基是根据植物生长所需营养成分，配制成的供植物生长的人工制作的营养物质,一、培养基的成分 培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调节剂三大基本组成成分。 1、无机盐类 功能 离体组织生长发育的基本成分 根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两类,大量元素植物所需元素的使用量一般在每升几十-几千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。 微量元素植物所需元素的浓度小于10-510-7mol/L，Fe、Cu、Zn、

5、Mn、Mo、B、Cl。 除C、H、O外，其它矿质元素通常以离子态吸收 N-硝态氮和铵态氮,2、有机化合物 培养基中只有无机盐叫做基本培养基，为使培养物更好的生长，还需添加有机成分，常用有糖类、维生素、醇类、嘌呤、氨基酸等。 糖类 功能 离体培养物生长与发育不可缺少的有机成分，即作为碳源，又维持培养基的渗透压在1.5-4.1MPa。 多使用蔗糖，试管苗生长与繁殖浓度2-3%，幼胚培养4-6%，某些特殊培养中用8-10%。 细胞和原生质体培养还用麦芽糖、葡萄糖、果糖,维生素类 功能 参与酶的形成、蛋白质、脂肪代谢，明显的促进离体培养物的生长。 盐酸硫胺素-VB1、盐酸吡哆醇-VB6、烟酸-Vpp、

6、生物素-VH、维生素C-Vc。 肌醇 功能 促进糖的转化、维生素和激素的利用，对胚状体和芽的形成有良好影响。 用量一般50-100mg/L,腺嘌呤 合成各种细胞分裂素的前体物质之一，利于细胞分裂，促进芽的形成和生长。 氨基酸 蛋白质的成分，是有机氮化合物，常用甘氨酸和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。 其它复合成分 成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等,3、生长调节物质 生长素类 功能 促进细胞脱分化和细胞伸长，诱导愈伤组织产生 生长素与细胞分裂素协调作用，在离体培养中，生长素促进根的形成，抑制芽的形成。 液体培养中利于体细胞胚胎发生。 常用IAA、I

7、BA、NAA、2,4-D,IBA促进生根,细胞分裂素的生理效应,细胞分裂素类 功能 促进细胞分裂和扩大，调节器官分化，延缓组织衰老，增强蛋白质合成。离体培养中，促进不定芽的发生，与生长素协调作用可有效控制培养物的生长与分化。 常用6-BA、ZT、KT、2iP,植株的形态建成是CTK和IAA的比值调控的 CTK/IAA高，诱导愈伤组织形成芽 CTK/IAA低，诱导愈伤组织形成根,烟草在不同细胞分裂素与生长素浓度下的生理效应,赤霉素类 功能 促进细胞伸长生长、诱导花芽形成、打破种子休眠以及诱导单性结实等。 与生长素协调作用对形成层分化有影响，刺激体细胞胚进一步发育成植株。 有20多种，目前主要是赤

8、霉酸GA3,4、水 离体培养中，既是培养基营养成分的溶剂，又是培养基的重要组成部分，占培养基成分的95%。 原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般应用双蒸水或超纯水 大批量快速繁殖培养，可用一般蒸馏水或纯净水,5、其它附加成分 琼脂 功能 来自海藻的多糖类物质，组织培养中最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支持物。 常用量0.6%-1.0%，不是培养基必需成分。 卡拉胶 海藻提取物，含杂质少纯度更高，凝固后培养基透明，利于材料观察,活性炭 功能 常用的吸附剂，某些培养类型中，可以吸附培养过程中产生的一些有毒物质（酚类物质），有利于培养物的生长。常用浓度15mg/L左右 其吸附作用选择性较

9、差，使用应慎重。常受温度影响，低温吸附效果好，高温吸附能力降低甚至解吸附,抗生素 培养基中添加抗生素可防止菌类污染，常用的抗生素有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量一般为520mg/L。大部分抗生素需要过滤除菌。 抗氧化物 抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及抗坏血酸（Vc），可用50200mgL的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤除菌后加入固体培养基的表层,二、常用培养基的种类、配方及特点 （一）培养基种类 1、根据态相分： 固体培养基-加凝固剂的培养基 液体培养基-不加凝固剂的培养基。 2、根据培养过程分： 初代培养基-初次接种外植体的培养基。 继代培养基-接种初代

10、培养之后培养物的 培养基,3、根据作用分： 诱导培养基-诱导外植体启动生长 增殖培养基-诱导离体培养苗扩大繁殖。 生根培养基-诱导离体培养苗生根 4、根据营养水平分： 基本培养基-包含无机盐等基本营养成分。 完全培养基-包含使植物离体生长全面营养,二）几种常用培养基 细胞工程常用的基本培养基有： MS、MT、White、Nitsch、 Blaydes、N6、B5、NT、 SH、Miller、Heller等,三）几种常见培养基的特点 1、富盐平衡培养基 无机盐浓度高，元素比例适当，离子平衡好，具有较强的缓冲性，培养中维持较好的稳定性，含高量氮、钾，营养丰富，元素种类齐全，MS培养基使用最广泛,2

11、、低盐培养基 无机盐浓度低，有机成分含量低，多数作为生根培养基、胚胎培养使用，常用White培养基。 3、高硝态盐培养基 较低铵盐，高硝酸盐和盐酸硫胺素B5培养基适合双子叶植物特别是木本植物的生长,N6培养基为水稻等禾谷类花药培养设计，KNO3和（NH4）2SO4含量高,不含钼。SH培养基 (NH4)H2PO4代替（NH4）2SO4,矿质浓度较高，多数单子叶和双子叶植物上使用较好,4、中盐培养基 大量元素无机盐为MS的1/2，微量元素种类减少含量增高，无肌醇维生素种类多，增加生物素、叶酸，有H、Hitsch、Miller、Blaydes等培养基，适用于特殊细胞培养,第二节 培养基的制备 制作一

12、升培养基所需药品20多种，为节省时间和配制的准确，需将各种药品浓缩成一定倍数，并且混合成一定母液，进行保存。制作培养基时根据需求制培养基数量取用母液,一、培养基母液的配制 （一）营养成分的配制 根据药品性质将母液配制成以下四类： 1、大量元素 可以混在一起配制成1020倍液，硫酸镁和氯化钙Ca+和Mg2+会与磷酸盐混合，产生不溶性沉淀，要分别单独配制Ca+与PO4-一起混合易沉淀，定容后消失,2、微量元素 可配成100200倍混合母液，KI可单独配。 3、铁盐 硫酸亚铁和EDTA钠盐易沉淀，需单独配制，配成100200倍鳌合剂不易沉淀。 4、有机化合物 维生素、肌醇、氨基酸等一起配成100或2

13、00倍液，也可分别配制,二）植物生长调节物质的配制 植物生长调节物质分别配成母液储于冰箱，浓度一般为0.51mg/ml。 1、IAA、NAA： 先用少量95%酒精使之充分溶解。 2、2,4D： 可用少量0.1mol/L的NaOH溶液充分溶解，再缓缓加蒸馏水定容至需要的体积,3、KT和BA等细胞分裂素类： 先用少量0.1mol/L 的HCl溶解，再用蒸馏水定容至需要的体积。 （三）药品用量的计算： 配制母液时药品用量(mg)=配方用量(mg)浓缩倍数制备容量（L,二、培养基的制作 （一）母液取用量的计算 制备培养基时母液取用量（ml）=1000浓缩倍数制备培养基数量（L,二）培养基制作程序 1、

14、按大量元素、微量元素、铁盐、有机成分顺序将母液取出，混合。 2、适量蒸馏水放入加热容器，蒸馏水应少于所制培养基数量，约终体积的2/3-3/4，接通电源加热。 3、向加热容器中加入称量好的琼脂（0.6-0.8%），搅拌加热，至完全溶化,培养基制作程序图,4、琼脂熬化后，称取相应量的蔗糖（2-3%），加入加热容器中至溶解。 5、将母液混合液加入到加热容器中，搅拌混匀。 6、蒸馏水定容至所需体积。 7、测试培养基溶液的PH值(5.8-6.0)，过高滴加0.1mol/L的HCL调整，过低滴加0.1mol/L的NaOH调整。 8、迅速分装到培养瓶中，备用,培养基是离体培养物赖以生存和生长的人工环境的重要

15、组成部分，常用的培养基依据其物理状态的不同分为固态培养基和液态培养基,固态培养基一般使用琼脂为凝固剂，也有使用卡拉胶或魔芋粉为凝固剂的。 液态培养基不使用凝固剂，但需要在容器中置入适当的支撑物，试管为培养容器的支撑物可用滤纸桥，底面积较大的培养容器，支撑物可选用脱脂棉等,固体培养基,三、培养基及培养器械的灭菌 制备好的培养基如果带菌，会导致植物离体培养失败，因而还要对培养基进行灭菌处理。 （一）高压蒸汽灭菌 培养基的灭菌一般采用湿热灭菌法： 1、培养瓶及培养器械放入高压灭菌锅。 2、灭菌锅加水至淹没电热丝,3、封闭高压灭菌锅各出气口。 4、接通电源加压至49kPa（0.05MPa） 5、打开排

16、气阀，排冷气至压力0 kPa。 6、继续加压至108kPa（0.11mPa-0.12Mpa，即121） 7、压力至108kPa（0.11mPa-0.12Mpa，即121）时，稳压在此压力15-20min。 8、关闭电源自然冷却至压力为0 kPa。 9、取出培养基和器械冷却，贮存于30以下室内,二）干热灭菌 培养瓶、三角瓶、试管等玻璃器皿及接种器械，可以进行干热灭菌。 即将洗涤干净的玻璃器皿放到烘箱中，在150温度下，干热灭菌1小时，或120下灭菌2小时。 灭菌完毕冷却后取出器械贮存,贮存室要保持无菌、干燥、以免造成培养基的二次污染。 灭菌后的培养基一般应在2周内使用，时间过长易造成潜在的污染。

17、 培养基灭菌后如果出现过多沉淀或琼脂不凝固等现象，该培养基不能继续使用，应查明原因重新配制,第三节 外植体无菌接种 一般来说，无论何种类型的细胞工程技术，起始阶段均涉及外植体取材、灭菌、接种与培养等基本过程,一、植物材料的培养与取材 外植体是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料，是植物离体培养的基础材料,1、外植体的来源 -生长在自然环境下的植物 -有目的地培育在温室控制条件下生长的植物 -无菌环境下已经过离体培养的植物 自然环境中生长的植株，一般带有微生物，甚至与某些微生物具有寄生关系，使植株具有内生菌。取自这些植物的外植体，在培养过程中会有微生物滋生，从而影响培养效果,已离体培养植株,

18、多数情况下，应尽量使用温室或人工气候室控制培养的植物材料作为外植体来源，减少培养过程中的微生物感染概率。同时，生长在控制条件下的植物可以保持培养料间的一致性，提高实验的可重复性，也便于培养技术的规范,某些多年生植物或特殊材料，必须取自自然生长的植物，就需要尽可能避免使用那些生长过于潮湿和不洁净环境中的植物。对于培养过程中可能出现内生菌污染的材料，应尽量取生长旺盛期的生长点部位作为起始培养的材料,2、供体植株的管理 取自室外的外植体材料，供体植株的管理十分重要，这与外植体培养时的污染率密切相关。植株管理中应注意： 避免昆虫危害 许多昆虫如蚜虫、螨类和飞虱是许多植物病虫害的传播媒介，会引起植物组织

19、的潜在感染,注意防病 尤其是真菌和细菌病害的侵染，取自感病植株的外植体，在培养中的污染率远远高于来自健康植株的外植体，必要时需使用化学药剂防治病害。 控制湿度 给供体植株浇水时应从根部给水，避免从上部浇水，以免上部形成易于病原侵染的湿度环境；尽可能降低温室湿度；取材前尽可能保持植株干爽,1、材料取材 材料选择 培养材料应选择有代表性的主要植物、选择性状优良的种质或特殊的基因型。 快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，花药培养应在花粉发育到单核期取材,选取材料的大小一般在0.5-1.0cm之间。胚胎培养或脱毒在0.5cm以下。材料太大易污染，材料太小难于成活。 采收 从生长健壮的无病虫害的植株上

20、选取发育正常的器官和组织。最好采用茎尖，后代性状较稳定，携带细菌较少,二、预处理与表面灭菌 1、预处理 先对植物材料进行修剪整理，去掉不需要部分，将准备使用的植物材料（外植体）在流水中冲洗20-60分钟，备用。如特别不洁的外植体，可先用加有洗涤剂的水清洗10-15分钟，再用流水冲洗干净,2、表面灭菌 （1）操作人员穿戴灭菌过的工作服、口罩。进入接种室前双手用洗涤剂清洗干净，操作前再用70%酒精或消毒剂擦洗双手。 （2）操作期间双手和台面常用70%酒精或消毒剂擦拭。超净工作台使用前必须用紫外灯照射杀菌，然后开启风机,3）接种用工具（解剖刀、剪刀、镊子）可放入70-75%酒精中，使用时需火焰灼烧灭

21、菌，冷却后使用。 （4）外植体放入超净工作台内，置70-75%酒精中5-60 秒，0.1氯化汞6-10分钟，或10%的漂白粉上清液中10-15分钟，然后用无菌水冲洗3-5次。灭菌时需进行搅动,表面灭菌剂种类较多，可选取1-2种使用。 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表 灭菌剂 使用浓度 持续时间 去除的难易 效果 次氯酸钙 9-10 5-30分钟 易 很好 次氯酸钠 2 5-30分钟 易 很好 氯化汞 0.1-1 5-10分钟 较难 最好 抗菌素 4-50mgL 30-60分钟 中 较好 酒精 70-75% 0.2-2分钟 易 好 过氧化氢 10-12% 5-15分钟 最易 好,三、外植体的接种无

22、菌接种 外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞、转放到无菌培养基上的全部操作过程。整个过程均需无菌操作。 （1）借助接种用工具将材料切割分离,2）将培养基放入超净工作台内，火焰灼烧培养基瓶口，然后打开培养瓶口，置培养瓶为斜角，避免灰尘落入平中。 （3）迅速将切割分离下的所需组织、细胞、器官，放入培养基上，及时盖上瓶盖。 （4）工具用后应及时灭菌，避免交叉污染。 （5）工作人员操作时禁止不必要的谈话,第四节 外植体的培养 接种只是完成了离体培养的第一步，植物离体培养和栽培植物一样，生长过程中也受到各种环境因素的影响。培养条件是离体培养能否成功的关键。在培养基条件适宜

23、的基础上，影响试管苗生长的主要因素有光照、温度、湿度、氧气,一、外植体的培养条件 1、光照 光照对植物生长发育有重要作用，是离体培养中非常重要的环境因素。光照强度、光质以及光照时间，对细胞的增殖、器官的分化都有很大影响。除特殊要求外，一般都采用日光灯作光源，光照强度1000-5000Lx，根据不同植物或器官需要，可以每天连续光照12-16小时，也可每天光照16小时，8小时黑暗,2、温度 离体培养中对温度的控制比光照更为重要，大所数植物最适温度在23-32之间。培养室温度是252。低于15时，培养的组织生长停顿，高于35对生长也不利。因此，培养室应安装空调机或其他的控温设备,3、湿度 培养瓶内相

24、对湿度通常是100%，而环境中的相对湿度会直接影响培养基的水分蒸发。因此，培养过程中，培养室一般要求相对湿度保持在70-80%，相对湿度过低影响培养物生长和分化，应向室内喷洒水，以提高湿度；过高杂菌滋生，大量污染，应及时地通风除湿,4、氧气 离体培养的试管苗是需要氧气的，在固体培养或液体静置培养时，如果组织完全浸入培养基中，与氧气隔绝，就会停止生长。因此，接种时要有部分组织合空气接触。振荡培养是解决通气的良好办法。固体培养中，如瓶塞不透气，培养物也不能生长，要选择通气性好的培养瓶盖，增加可利用的氧气，迅速除去释放出来的CO2，有利于外植体外层细胞开始分裂,二、外植体的成苗途径 外植体的成苗途径

25、有三种： （一）外植体-愈伤组织-完整植株。 具体又可分为三种： 1、愈伤组织-同时长芽和根-植株。 2、愈伤组织-茎-根-植株。 3、愈伤组织-根-芽-植株,二）外植体-胚状体-植株。可从以下几种培养物中产生： 1、器官上发生。 2、愈伤组织上发生。 3、游离单细胞发生。 4、小孢子发生。 诱导胚状体比诱导芽数量多、速度快、结构完整。 （三）外植体-直接形成根与芽-植株。如茎尖培养,三、培养中常见问题 （一）污染的原因及其预防措施 1、污染原因 污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。 病原菌：细菌及真菌两大类,细菌污染特点-菌斑呈黏液状，接种后1-2天发现。

26、污染途径： 外植体带菌 培养基及器皿灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 真菌污染的特点-污染部分长有不同颜色的霉菌，接种后3-10天发现。 污染途径： 周围环境不清洁 超净工作台过滤装置失效 培养瓶的口径过大,2、污染的预防措施 防止材料带菌的措施 -茎尖作外植体时，进行预培养（无糖）或暗培养。无糖营养液或自来水使枝条抽枝，以新抽嫩枝作外植体。 -晴天取材，下午取材，经日晒过可杀死部分细菌或真菌。 -接种时除去外部韧皮组织，只接内部的分生组织,2）外植体的灭菌 -多次灭菌法，次氯酸钠-无菌水-次氯酸钠 -多种药液交替浸泡法，肥皂水-酒精-次氯酸钠-无菌水,器皿与金属器械的灭菌 玻璃器皿可采用湿

27、热灭菌或干热灭菌 金属器皿一般火焰灭菌，也可干热灭菌 布质制品的灭菌 湿热灭菌 无菌操作室的灭菌 2%新捷尔灭或70%酒精擦拭（喷雾），紫外灯照射，定期甲醛和高锰酸钾熏蒸。 严格按照操作程序,二）外植体的褐变及其防止措施。 1、褐变的原因 褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死的褐变物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，抑制其它酶的活性，影响外植体的分化，最后变褐死亡的现象,基因型 某些植物酚类物质含量较多。 外植体的生理状态 幼年的材料培养含醌类物质较少。 培养基的成分 -过高的无机盐浓度 -生长调节物质使用不当，BA过多 -分生能力

28、强的材料，氧化受抑制，褐变也被抑制 -培养条件不适宜，温度过高或光照过强，褐变加速。 材料转移时间 时间过长引起材料褐变,2、褐变的防止措施 选择适宜的外植体及最佳培养基。 连续转移。 加抗氧化物。 加活性炭。0.1-0.5%活性炭,三）玻璃化现象及其预防措施 1、玻璃化现象及其产生原因 玻璃化是在细胞生长过程中的环境产生变化，试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。主要原因是： 激素浓度 BA浓度提高，导致玻璃化苗的产生。 琼脂浓度 琼脂浓度低，玻璃化苗增加,温度 低温易形成玻璃化苗。 光照时间 一般要求10-12h，大于15h玻璃苗增加。 通风条件 培养瓶容量小，气体交换不良，玻璃化苗多。 离子水平 植物种类不同，离子形态比例量要求不同,2、预防措施 控制无机营养成分，降低氮（铵态氮）和氯。 提高蔗糖和琼脂浓度 降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生长素比例。 增加自然光照1000-1800lx，控制光照时间8-12h。适温生长，热击处理防止玻璃化发生。 使用透气性好