本科毕业论文-油茶叶多酚和黄酮综合提取工艺的优化

1、JINGCHU UNIVERSITY OF TECHNOLOGY本科毕业论文油茶叶多酚和黄酮综合提取工艺的优化学 院：生物工程学院2014年4月目录中文摘要 错误！未定义书签。英文摘要 错误！未定义书签。1实验材料与方法 61.1实验原料61.2主要试剂61.3主要仪器与设备61.4实验方法61.4.1 油茶叶多酚与黄酮的有机溶剂提取法 61.4.2总酚含量的测定71.4.3黄酮含量的测定71.4.4正交实验设计82结果与讨论92.1多酚标准曲线92.2黄酮标准曲线92.3实验结果102.4讨论各因素对提取量的影响 112.4.1 提取时间对油茶叶中多酚和黄酮提取效果的影响 112.4.2乙醇

2、浓度对多酚和黄酮提取量的影响 112.4.3料液比对多酚和黄酮提取量的影响 122.4.4 提取温度对多酚和黄酮提取量的影响 123总结12油茶叶多酚和黄酮综合提取工艺的优化摘要：我国油茶资源十分丰富，禾U用潜力巨大，开发油茶叶黄酮及油茶叶多酚有着重要的现实意义和十分广阔的前景。油茶树是我国独有的一种木本油料资源，油茶中含有大量的黄酮类化合物和多酚类物质。油茶种植的发展必须重视油茶的综合开发利用，只有这样才能使得油茶种植的综合效益得到进一步体现。本文采用正交试验法对油茶叶中提取多酚和黄酮的最佳工艺条件进行研究，设计了以乙醇中作为溶剂从油茶叶中提取多酚和黄酮的实验，通过对溶剂浓度、提取温度、提取

3、时间、料液比这 4个单因素进行正交试验。用分光光度计法测定了不同实验条件下提取的油茶叶多酚和黄酮的含量。结果表明从油茶叶中综合提取黄酮和多酚的最佳工艺条件为：乙醇浓度60%提取温度80C，提取时间40min，料液比1:15.关键词：油茶叶；多酚；黄酮；综合提取；乙醇16Optimization of comprehensive extraction technology of camelliaoleifera leaf polyphenol and flavonoidsAbstract: China has abundant Camellia oleifera resource. The ut

4、ilization potential is very large. The developme nt of camellia oleifera leaf flav ono ids and leaf polyphe nol has importa nt realistic sig ni fica nee and also broad prospects. Camellia oleifera is a particular woody oil pla nt resource in our coun try, containing a large nu mber of flav ono ids a

5、nd polyphe nol. The developme nt of pla nting camellia oleifera must pay much attention to the comprehensive development and utilization of camellia oleifera. Only by this can comprehe nsive ben efits of camellia cultivatio n be realized. This article studies optimal tech no logical con diti on of e

6、xtract ing flav ono ids and polyphe nol from camellia oleifera leaf by orthog onal test, and desig n a test of using ethyl alcohol as solve nt to extract ing flav ono ids and polyphe nol from camellia oleifera leaf.Orthogo nal test was made on the base of 4 sin gle factors: solve nt concen trati on,

7、 extract ing temperature, extract ing time and ratio of material to solve nt. The content of extracted flav ono ids and polyphe nol in differe nt experime nt con diti ons was detected by the spectrophotometer. The results showed that the optimal tech no logical con diti on of extract ing flav ono id

8、s and polyphe nol from camellia oleifera leaf is 60% ethyl alcohol concentration, extracting temperature 80C , extracting time 40 min and ratio of material to solve nt 1:15.Keywords: camellia oleifera leaf; polyphe nol; flav ono ids; comprehe nsive extract ion; ethyl alcohol油茶，茶科，常绿小乔木。因其种子可榨茶油供食用，故

9、名。茶油色清味香，营养 丰富，耐贮藏，是优质食用油；也可作为润滑油、防锈油用于工业 。茶饼既是农药，又是肥料，可提高农田蓄水能力和防治稻田害虫。果皮是提制栲胶的原料。叶部含有花 黄素、茶碱等，是医药工业的原料。木材可做小型农具。油茶树高达46米，一般23米。树皮淡褐色，光滑。单叶互生，革质，椭圆形或卵状椭圆形，边缘有细锯齿，长3-10 厘米，宽1.5-4.5厘米，花顶生或腋生，两性花，白色，直径 6-9厘米，花瓣倒卵形，顶 端常二裂。蒴果球形、扁圆形、橄榄形，直径 3-4厘米，果瓣厚而木质化，内含种子。 种子茶褐色或黑色，三角状，有光泽。植物多酚是一类广泛存在于植物体内的大分子化合物，主要存在

10、于植物的皮、根、木、 叶、果中，植物多酚由于其羟基取代的高反应性和吞噬自由基的能力而有很好的抗氧化活 性。研究发现：植物多酚不仅起着对油脂的抗氧化作用，而且还能延缓机体的衰老，抑制癌 症、糖尿病、白内障、动脉粥样硬化、肾小球疾病、心肌梗塞、高血压等疾病的发生，而这些功能都与多酚的抗氧化性能有着密切的关系。因此，国内外对多酚的研究和应用方兴未艾，对植物多酚研提取工艺报道的比较多是茶多酚、苹果多酚、葡萄籽多酚等。黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连结 而成的一系列化合物，其基本母核为 2-苯基色原酮。天然黄酮类化合物多以苷类形式存 在，并且由于糖的种类、数量、

11、联接位置及联接方式不同可以组成各种各样黄酮苷类 o 组成黄酮苷的糖类包括单糖、双糖、三糖和酰化糖。黄酮苷固体为无定形粉末，其余黄 酮类化合物多为结晶性固体。黄酮类化合物不同的颜色为天然色素家族添加了更多色彩。 这是由于其母核内形成交叉共轭体系，并通过电子转移、重排，使共轭链延长，因而显 现出颜色。黄酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等极性强的溶剂中；但难溶于或不溶于苯、 氯仿等有机溶剂中。糖链越长则水溶度越大。黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故 显酸性。酸性强弱因酚羟基数目、位置而异。茶叶的提取是指将茶叶加入溶剂中，使茶叶中各种可溶性化学成分溶出，从而使茶 叶中可溶物与不可溶物达到完全分离的过程。

12、不论采用哪一种方法提取茶多酚，溶剂浸 取是其必须采用的工艺步骤。茶叶具有不均匀性和多样性，因而，研究了解茶叶在浸提 过程中内含成分的浸出过程，对浸提的工艺技术制订和品质控制，具有十分重要的意义。 实验和分析研究表明，茶叶中内含物浸出一般可分为三个阶段。黄酮类化合物不但分布范围广，种类多，而且生物活性广泛，它不仅可做功能性食 品添加剂。如甜味剂、抗氧化剂风味增强剂等5 o还可做一些功能食品，如防衰、防癌、 提高免疫力、降脂、降压食品，产品外观覆盖到液体、固体和半流体等多种形式，目前 应用最多的是它的抗氧化、抗衰老功能及其他新功能。多酚类物质和黄酮类物质因为具有较高的经济价值，已吸引了很多学者的研

13、究目光， 越来越多的研究围绕着植物多酚和植物黄酮的提取，但多数的研究只探讨单一物质的提取效果，而本研究通过正交试验摸索从油茶叶中同时提取多酚和黄酮的最佳工艺，期 望通过一次提取能获到最优结果。1实验材料与方法1.1实验原料油茶叶采自湖北省京山县虎爪山森林公园。1.2主要试剂乙醇、鞣酸、酒石酸亚铁溶液、酒石酸钾钠、磷酸二氢钾、十二水磷酸二氢钠、芦 丁、亚硝酸钠、硝酸铝（分析纯购自武汉科普化学试剂有限公司，标准品鞣酸购自荆州 昌华科教仪器有限公司）1.3主要仪器与设备冷凝管、烧杯（500mL、250mL、100mL、50mL）、圆底烧瓶（500mL、250mL ）、 试管、量筒、可见分光光度计、

14、JY20002电子分析天平（D3004564，MAX=2000g,e=0.1g, d=0.01g）、旋转蒸发仪（供应宏朗RE-5000）、电热恒温水浴锅（DK-98-11，天津市泰斯特 仪器有限公司）、真空抽滤机（天津科诺仪器设备有限公司）、铁架台1.4实验方法1.4.1油茶叶多酚与黄酮的有机溶剂提取法在油茶叶的提取方法中，有离子沉淀法、微波浸取法、超声波萃取法和有机溶剂法 等一系列方法。在现有条件下，本实验采取有机溶剂提取法，主要因为此种方法在实 验中已有成熟运用，在节约时间、成本的同时能熟练操作。以下为本实验操作流程：干燥油茶叶并粉碎 5g每份加入圆底烧瓶检测 浓缩 水浴加热 圆底烧瓶中加

15、入有机溶剂1.4.2总酚含量的测定1.421标准溶液配置称取鞣酸0.25g,加蒸馏水定容至250mL，得到浓度为1mg/mL的标准溶液1.4.2.2标准曲线绘制分别吸取茶多酚标准液 0、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL，分别加蒸馏水至1mL， 再加酒石酸亚铁溶液1mL，加入pH为7.5的磷酸缓冲液至5mL，用第一管做空白对照， 于540nm处测定吸光值，绘出标准曲线。酒石酸亚铁溶液：0.25g （准确到0.0001） FeSO4?7H2O，1.25g酒石酸钾钠，用蒸馏 水水溶解并定容至250mL （低温保存有效期为10天）。pH 7.5的磷酸缓冲液配置：A液为1/15mol/L磷

16、酸氢二钠溶液：2.39g十二水磷酸二 氢钠，加水定容至100mL。B液为1/15mol/L的磷酸二氢钾溶液：称取经 100C烘干2h 的磷酸二氢钾0.908g,加水后定容至100mL。取A液85mL和B液15mL混合备用9。1.4.2.3多酚含量的测定将样品浓缩得到浸膏后，加蒸馏水 5mL。吸取0.1mL，加蒸馏水至1mL，再加酒石 酸亚铁溶液1mL，加入pH为7.5的磷酸缓冲液至5mL，放置于540nm处测定吸光值， 在标准曲线中找到对应的浓度，计算样品液中的多酚含量10。1.4.3黄酮含量的测定1.4.3.1芦丁标准溶液的配制称量13.2mg芦丁，用60%乙醇定容到25ml容量瓶作为标准溶

17、液。1.4.3.2标准曲线的制作准确吸取0mL，1mL， 2mL， 3mL， 4mL，5 mL芦丁标准溶液，放入10毫升容量 瓶内（写明标记），分别加入5 mL、4mL、3mL、2mL、1mL、0 mL的60%乙醇溶液； 再加入5%亚硝酸钠溶液0.5ml摇匀，放置6min ；加入10%硝酸铝溶液0.5ml,放置6min 后；加入4%氢氧化钠溶液4.0mL，加60%乙醇定容，摇匀后，放置15min；用第一管作 为空白对照管，在510nm处测定吸光度。用0.0ml作为空白，用芦丁含量的浓度作为横 坐标，纵坐标作为一定浓度下所对应的吸光度，作标准曲线11。143.3黄酮含量的计算1225mVpIO6

18、式中：X 样品中总黄酮含量 g/5g或g/25mLmi根据标准曲线计算出待测液中黄酮的量冯m 样品质量或样品体积g或mLVi样品提取液测定用体积mLV2样品提取液总体积mL1.4.4正交实验设计对从油茶叶中提取多酚和黄酮的影响因素有很多，通过对各种文献的总结发现，公 认的影响大的因素有乙醇浓度、水浴加热温度、水浴加热时间和料液比等四因素，所以 本实验只对这四因素的改变来确定最佳提取工艺，通过正交试验法，可以实现通过少数 的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果 。正交实验中乙醇浓度、水浴加热温度、水浴加热时间和料液比这四个因素各取三 个水平，见表1。正交试验具体方案套用正交试验表安

19、排，见表2.表1正交实验因素水平水平乙醇浓度%温度C时间min料液比g/mL14550401:1026065601:1538080801:20表2正交试验组数确定因素乙醇浓度%温度C时间min料液比g/ml实验一4550401:10实验二4565601:15实验三4580801:20实验四6050601:20实验五6065801:10实验六6080401:15实验七7550801:15实验八7565401:20实验九7580601:102结果与讨论2.1多酚标准曲线按照1.4.2的方法，将茶多酚标准溶液在540nm处测定吸光值，以吸光值为纵坐标， 多酚含量为横坐标，得出标准曲线的回归方法。线性

20、回归方程为：丫=0.012X+0.008，相关系数为：氏=0.999，多酚标准曲线见图1.图1多酚标准曲线2.2黄酮标准曲线按照1.4.3的方法，将黄酮标准溶液在 510nm处测定吸光值，以吸光值为纵坐标， 黄酮含量为横坐标，得出标准曲线的回归方法。线性回归方程为：丫=9.5659X+0.0025,相关系数为：R=0.9996，黄酮标准曲线见图2。值光吸TO0020030户丁含量（mg/mL）图2黄酮标准曲线2.3正交试验结果从表3可知，多酚的最佳提取工艺为 A2B1C1D2根据极差值的大小，得出影响多酚得率的因素依次为ADBC表3多酚正交试验提取效果因素A :乙醇浓度% B:提取温度cC :

21、提取时间min D：料液比g/ml实验结果 mg/g实验一4550401:1016.722实验二4565601:1518.344实验三4580801:2015.921实验四6050601:2018.074实验五6065801:1017.263实验六6080401:1518.873实验七7550801:1517.271实验八7565401:2016.091实验九7580601:1013.827均值一16.99617.32217.22915.937均值二18.0717.23316.74818.129均值三15.69616.20716.78516.695极差2.3741.1150.4812.192从

22、表4可知，黄酮的最佳提取工艺为 A2B1C1D2根据极差值的大小，得出影响黄酮得率的因素依次为ABDC表4黄酮正交试验提取效果因素A :乙醇浓度% B:提取温度cC :提取时间min D:料液比g/ml实验结果mg/g实验一4550401:1069.825实验二4565601:1569.173实验三4580801:2078.256实验四6050601:2075.477实验五6065801:1080.052实验六6080401:1582.928实验七7550801:1583.651实验八7565401:2088.271实验九7580601:1092.302均值一72.41876.31880.34

23、180.726均值二79.48679.16578.98478.584均值三88.07584.49580.65380.668极差15.6578.1771.6692.1422.4讨论2.4.1提取时间对油茶叶中多酚和黄酮提取效果的影响从表3可看出，提取时间对多酚的提取量多少的影响最小，极差只有0.481。当然，随着时间的增加，多酚的提取也有相当的时间呈稍微的上升趋势，主要原因可能是时间越 长，多酚物质的溶解越充分。在 60min达到峰值后，细胞内的有效成分基本析出，再增加时 间,析出的多酚由于受光、热、多酚氧化酶 PPO的影响，极易被氧化，因此，应选择40min为 最佳提取条件。从表4可以看出，提

24、取时间对在油茶叶中提取黄酮的影响最小，不论时间是 40min、 60min、80min时，对提取量来说，不会改变其太大，但也可以看出当时间从 60min到80min 过程中，提取量在细微的增加。总的来说，提取时间对多酚和黄酮的提取都是最小的影响因素，对多酚的最优提取 时间为40,min，对于黄酮的最优提取时间为 40min或80min，考虑到节约成本等因素， 我们选取40min作为最优提取时间。2.4.2乙醇浓度对多酚和黄酮提取量的影响从表3可看出，乙醇浓度对多酚的提取量影响最大，在45%60%之间时，多酚的提取量迅速增加，在60%75%之间呈缓慢下降趋势。原因可能是随着乙醇浓度的增大多酚-蛋

25、白质等的连接键被逐步破坏，多酚在乙醇水溶液中的溶解度增大，在乙醇浓度60%达到 峰值,之后溶剂中的水分越来越少，所以通透性越来越差，细胞内的多酚物质向外扩散的难 度大,所以提取率低，另外一个原因也许是高浓度的甲醇易于挥发，间接降低了料液比，使多 酚溶解度降低，所以选择60%左右的乙醇浓度比较合适。同时，从表4来看，乙醇浓度对油茶叶中黄酮的提取影响也是最大的，影响原因与 多酚相似。当乙醇浓度为75%时黄酮的提取量最大，但当乙醇浓度为 75%时多酚提取量 是三个水平中最低的，所以综合考虑确定乙醇浓度最适值为60%。243料液比对多酚和黄酮提取量的影响从表3可看出，多酚的提取量随着料液比的增加呈上升

26、趋势，这是由于油茶叶组织内部 与外周的多酚的浓度差异随之增大，提高了提取率，但料液比达到1 : 15(W : V)时,内部与 外部之间的浓度已趋于平稳。从表4看出料液比对黄酮的提取的影响还是比较小的，且无规律可循，这可能是由 于对于5g的油茶叶，1:10的料液比已经足够用了，或者已经达到了最大值。因此，料液 比的最佳值取1:15。2.4.4提取温度对多酚和黄酮提取量的影响从表3可看出，油茶叶中多酚的提取量在80C是存在两个极端，最小和最大，但根据 我们前面对提取时间、因此浓度和料液比的确定最佳值，带入到表3中可见当温度去80C 刚好为多酚提取的最大值，所以对多酚来说最佳温度为80C。从表4可看

27、出，温度对黄酮的提取有一定影响，但没因此浓度强，所以重要性在因 此浓度之后，前面我们确定乙醇浓度最佳值为 60%在这个基础上，可由表4看出最佳温 度为40 C和80 C。因此，从综合提取的角度来说，选择最佳温度为80C。3总结根据表3和表4,同时结合以上分析，我们可以得出。在对油茶叶中提取多酚和黄 酮的影响因素中，乙醇浓度起着决定性因素，他对两者的影响都很大，水浴加热温度对 提取量有一定影响，时间对两者的影响都不大，可忽略不计。最终得出，在油茶叶中综合提取黄酮和多酚的最佳工艺为乙醇浓度60%、水浴加热温度80C、水浴加热时间40min、料液比1:15。按照这个实验方案进行了三组平行实验 取平均

28、值，结果如表5:多酚的平均提取量为19.407mg,黄酮得率为94.509mg,均高于正交试验中的任何一组，这表明该综合提取工艺条件稳定可行表5平行实验结果实验号123平均值多酚提取量19.72618.41320.08719.407黄酮提取量97.20493.49492.83694.509本实验为油茶叶的资源开发和综合利用提供了实验依据，对于拓展油茶产业链、增 加油茶产品的附加值具有重要意义。参考文献:1 朱彬.油茶活性成分研究进展与展望经济林研究.2010 ( 9) .(140-141)2 陈跃龙.油茶叶的化学成分.沈阳药科大学学报.1006-2858 ( 2010)04-0292-03.(292-293)3 陈铃容.茶多酚