分子生物学实验实验操作.ppt

1、a,1,重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建,分子生物学实验-实验操作,a,2,基因、载体、受体菌株,基因,载体,菌株,质粒,酶切连接,转化,质粒提取,PCR,a,3,实验技术要求,应掌握的实验技术 酶切,连接 凝胶回收 制备感受态细胞 质粒提取 PCR 琼脂糖凝胶电泳,考察指标 电泳 电泳 感受态细胞转化率 电泳 电泳 电泳,a,4,实验流程: 第一天,rhIL-18基因的PCR产物,质粒pUC18,Bgl和Pst双酶切,BamH和Pst双酶切,浓度1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶回收,配制 LB 液体与固体平板培养基,灭菌,a,5,实验流程: 第二天,凝胶回收与溶液回收,电泳检验,

2、T4连接酶连接过夜,E .coli DH5菌株 37过夜培养,a,6,实验流程: 第三天,提取质粒DNA,浓度1%琼脂糖凝胶电泳,a,7,实验流程: 第四天,PCR,浓度1%琼脂糖凝胶电泳,a,8,双酶切反应（20L体系,rhIL-18的PCR产物 PCR产物 10L Buffer O 2L 无菌水 7L Bgl 0.5L Pst 0.5L,质粒pUC18 质粒 10L BamH Buffer 2L 无菌水 6.7L BamH 0.3L Pst 1L,37酶切反应3小时,a,9,Hybrid site,a,10,培养基配制,LB液体培养基 每1L配量： 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠

3、 5g 调节pH到7.0 LB固体培养基: 每100ml液体培养基添加1.5g琼脂 每组准备： 1个30ml 液体培养基,a,11,灭菌,1个30ml LB 液体培养基 微量移液器枪头（200uL,a,12,琼脂糖电泳,琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA 片段的标准方法。 DNA 的分子大小 琼脂糖浓度 DNA 分子的构象 电源电压 嵌入染料的存在 离子强度影响,a,13,琼脂糖凝胶回收,琼脂糖凝胶电泳检验，回收酶切产物：使用UNIQ-10柱式凝胶回收试剂盒 分别对： 目的基因片段（0.5Kb片段）溶液回收 载体片段（2.7Kb片段）进行凝胶回收,a,14,1.通过琼脂糖凝胶电泳将目的DNA

4、片段与其他片段尽可能分开，然后用干净的手术刀切下含需回收DNA的琼脂块，放入Ep管。 2.按300L/100mg（3:1）的比例加入 Binding Buffer，置于50-60水浴中10min，使凝胶彻底融化。期间，每2 min混匀一次。 3.将融化的溶胶液转移到套在 2-ml 收集管的UNIQ-10柱中，室温放置 2 min。12000 rpm 室温离心 1 min。 4.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500L Wash Solution，12000 rpm 室温离心 1 min。 5.重复步骤4一次,琼脂糖凝胶回收,a,15,6.取下

5、UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将 UNIQ-10 柱放入同一个收集管中，12000 rpm 室温离心 2 min。 7.将 UNIQ-10 柱放入一根新的 Ep 管中，在柱子膜中央加30L Elution Buffer，60放置 5min。 8.12000 rpm 室温离心 1 min ，离心管中的液体即为回收的DNA片段。 从溶液中回收DNA： 根据溶液的体积，加入 3 倍体积的 Binding Buffer混匀。 以下操作参照琼脂糖凝胶中回收DNA步骤3-8,a,16,计算基因与载体片段比例,紫外下观察基因与载体片段的亮度 基因的摩尔数基因片段亮度/碱基数（495bp） 载体的摩尔

6、数载体片段亮度/碱基数（2700bp） 基因摩尔数/载体摩尔数 最佳比例是3：1,a,17,连接反应,在灭菌的0.2mL离心管（PCR管）中进行 20L体积反应体系中： 10快速连接缓冲液 2L rhIL-18双酶切产物 X L 质粒pUC18双酶切产物 Y L T4-DNA连接酶 1L 201h，4 过夜,a,18,感受态菌的制备,1）E.coli DH5菌株37过夜培养以复苏菌种，取过夜培养的菌液0.3mL加入到30 mL LB培养基中，37，230 r/min振荡培养3 h，至OD600约为0.4左右。 （2）无菌条件下，将50mL菌液转移至离心管中，冰上放置10 min，使培养物冷却至

7、0。 （3）在预冷4的离心机上以4000r/min离心10min，弃去上清，加入30mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬沉淀，冰浴上放置10 min。 （4）以4000r/min在4离心10min，弃去上清，每30mL初始培养物用1.0mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬细胞沉淀，200L/管分装,a,19,pUC18-hIL-18重组质粒的转化,1）向分装有200LE.coli DH5菌株感受态细胞的EP管中加入10L的上步中得到的连接混合物，轻轻旋转以混合内容物，冰浴上放置30 min。 （2）将该EP管放入预加温至42的水浴中，放置90s，快速转移到冰浴中，使细胞冷却1

8、2 min。 （3）向EP管加入800 L LB培养基，转移至37摇床上，150r/min，温育45 min以复苏菌株,a,20,4）将200L上述培养物加到含100g/mL氨卞青霉素的LB平板上，以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平铺于琼脂平板表面。 （5）将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平皿，37过夜培养，筛选鉴定,a,21,UNIQ-10柱式质粒小量抽提,1 将过夜培养的12ml细菌12,000rpm离心1 min，彻底去除上清。 2 加入250l Solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。 3 加入250 l Solution II，立即温和混匀（倾斜45度角，顺一个方向，慢慢

9、旋转离心管），使细菌裂解，室温放置2分钟。 4 加入350l Solution III，立即上下颠倒510次，使之充分中和，室温放置5分钟。 5 12,000rpm，离心10分钟。 6 将步骤5中上清转移到套放于2.0ml收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2 min后，8,000rpm室温离心1 min。 7 弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一支收集管中，吸取500l Wash Solution到UNIQ-10柱，10,000rpm室温离心1 min。 8 重复步骤7。 9 弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一支收集管中，12,000rpm室温离心2 min以彻底去除Wa

10、sh Solution。 10 将UNIQ-10柱放入新的洁净1.5ml离心管中，加30l Elution Buffer，60放置10 min后，10,000rpm室温离心1分钟。离心管中的溶液即为所抽提的质粒DNA,a,22,PCR鉴定阳性克隆原理,a,23,PCR鉴定,1、调整模板（ 待鉴定质粒）浓度至 5 ng/ L 2、按下列体系配制反应混合液，混匀， Template DNA 1.0 L 10 PCR buffer 2.0 L MgCl2（25mmol/L） 1.5 L M13 Primer M4 (10mol/L) 0.5 L M13 Primer RV(10mol/L) 0.5 L dNTPs （2mmol/L） 2.0 L Taq酶 （5U/L） 0.5L 加ddH2O至 20L,外源基因的特异引物： 引物M13 Primer M4:（5-GTTTTCCCAGTCACGAC-3） 引物M13 Primer RV: （ 5-CAGGAAACAGCTAAC-3,a