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文档简介
1、.蛋白提取实验步骤:1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞,每106细胞加250 ul RIPA(在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂),振荡。如果需要提高蛋白浓度,可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次彻底吸干残留液。b、加入适当体积的 RIPA(使用前数分内加入蛋白酶抑制剂)于培养板、瓶内3-5分钟。期间反复晃动培养板、瓶,使试剂与细胞充分接触。c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下,收集到1.5ml离心管中。C、冰浴30min,期间用移液器反复吹打,确保细胞完全裂解。D、12000g离心5min,收集上清,即为总蛋白溶液。2、组织蛋白
2、提取:A、组织块用冷TBS洗涤2-3次,去除血污,剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)冰上彻底匀浆。如果需要提高蛋白浓度,可以适量减少该试剂体积。B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中,振荡。冰浴30min,期间用移液器反复吹打,确保细胞完全裂解。C、12000g离心5min,收集上清,即为总蛋白溶液。注意事项1、组织尽可能新鲜,若不能及时提蛋白,组织标本应保存在-80冰箱,并避免反复冻融。2、全程必须在冰上进行,避免蛋白降解。3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定,需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器(200l)
3、反复吹打,或再加入适量裂解液以保证充分裂解。5、总蛋白溶液不稳定(蛋白酶依旧有活性)可在-80短时间保存,建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20保存,避免反复精品佳作,安心下载,放心使用冻融。遇到失意伤心事,多想有一个懂你的人来指点迷津,因他懂你,会以我心,换你心,站在你的位置上思虑,为你排优解难。一个人,来这世间,必须懂得一些人情事理,才能不断成长。就像躬耕于陇亩的农人,必须懂得土地与种子的情怀,才能有所收获。一个女子,一生所求,莫过于找到一个懂她的人,执手白头,相伴终老。即使芦花暖鞋,菊花枕头,也觉温暖;即使粗食布衣,陋室简静,也觉舒适,一句“懂你”,叫人无怨无悔,愿以自己的一生来交付。懂得是彼此的欣赏,是灵魂的轻唤,是惺惺相惜,是爱,是暖,是彼此的融化;是走一段很远的路,蓦然回首却发现,我依然在你的视线里;是回眸相视一笑的无言;是一条偏僻幽静的小路,不显山,不露水,路边长满你喜爱的花草,静默无语却馨香盈怀,而路的尽头,便是通达你心灵的小屋瑟瑟严冬,窗外雪飘,絮絮自语说了这多,你可懂我了吗?若你知晓,无需说话,只报一声心灵的轻叹,那,便是我的花开春暖。你相不相信,人生有一种念想,不求奢华不求结果,不求你在我身
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