杀菌剂生物测定技术

1、第三章 杀菌剂生物测定技术,杀菌剂室内生物测定的主要内容是将杀菌物质作用于细菌、真菌或其他病原微生物，根据其作用的大小来判定药剂的毒力。或将杀菌物质施于植物，对病害发生的有无或轻重观察比较来判定药剂的效果,供试病原菌要求 在分类上有一定代表性，最好是重要的农业植物病害的病原菌， 而且容易培养， 多代繁殖不易产生变异,一、供试菌种,番茄灰霉病菌（Botrytis cintrea） 番茄早疫病菌（Alternaria solani） 辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici） 苹果轮纹病菌（Physalospora berengeriana） 苹果炭疽病菌（Glomerella

2、cingulata） 苹果腐烂病菌（Valsa mali） 葡萄黑痘病菌（Elsinoe ampelina） 葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella,常用的供试菌种,水稻稻瘟病菌（Piricularia oxyzae） 小麦赤霉病菌 (Gibberella zeae) 小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis） 玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum） 玉米弯孢病菌（Curvularia lunocto） 棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium） 枯草杆菌（Bacillus subtilis） 白菜软腐病菌（Erwini

3、a carotovora sub sp.carotovora） 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas campestrispv.oryzae）等,1 从大量合成化合物中筛选出有可能作为杀菌剂的化合物 2 为特定的植物病害寻找有效的药剂，为此需要进行筛选杀菌剂毒力的比较 3 杀菌剂作用方式及作用机制的研究,二、杀菌剂生物测定的应用,4 杀菌剂抗性的研究 5 杀菌剂混用及剂型研究 6 杀菌剂抗雨水冲刷能力及残效作用的研究 7 某些杀菌剂（特别是农用抗菌素）的微量分析,孢子萌发法 管碟法 含毒介质培养法滤纸片法 抑菌圈法 孔碟法 生长速率法 最小浓度法 叶碟法,三、杀菌剂室内主要生测方法,孢子萌发

4、法是历史最悠久而广泛被采用的杀菌剂毒力测定方法。早在1807年。Prevost 就采用此法，后经不少学者改进，使之日趋规范、合理,1.孢子萌发法,原理：都是将供试药剂附着在载玻片上或其他平面上，然后将供试病菌孢子悬浮液滴在上面（或将施于悬浮液和药液混合后滴在玻片上），在保温，保温条件下培养一定时间后镜检，以孢子萌发率判断杀菌剂毒力。孢子萌发法的突出优点是快速，试验当天即可获得结果，尤其适合于保护剂的筛选,以病菌孢子作为指示物进行杀菌剂毒力测定。用孢子液和不同浓度的药液混合，恒温保湿培养，培养一定时间后即可检查孢子萌发率。一般在低倍镜下，每处理随机检查200个孢子,孢子萌发的标准,孢子萌发率（%

5、）萌发孢子数/检查孢子数X100 若对照组有20%以上孢子不萌发，则应重做。 对照萌发率处理萌发率 抑制孢子萌发率（%）X100 对照萌发率,抑制率计算,将抑制孢子萌发率换算成机率值，作为Y；药剂的浓度以对数值来表示作为X，直线回归，求得回归方程Ya+bx，可得LC50和LC95.,LC50 和LC95的计算,孢子萌发法只适用于产生孢子的真菌。 一般的供试病菌有： 马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans） 水稻稻瘟病菌（Piricularia oryzae） 小麦赤霉病菌（Gibberella zeae） 玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum,孢子萌发法

6、的适用范围,2.含毒介质培养法,有3种： （1）抑菌圈法 （2）生长速率法 （3）最小浓度法,基本原理是在已经接种供试菌的洋菜培养基（通常在培养皿内）表面，利用各种方法（管碟法，滤纸片法，孔碟法 ）使药液和培养基接触，恒温培养一定时间后，由于药剂的渗透扩散作用，施药部位周围的病菌被杀死或生长受到抑制，从而产生了抑制圏。根据抑菌圈的大小来比较不同杀菌剂的毒力大小,1）抑菌圈法的原理,抑菌圏法的优点 精确度高 操作简单 抑菌圏法的缺点 溶解性 扩散性,抑菌圏法的优缺点,抑菌圈法示意图,含有孢子的培养基,不同浓度的药液,根据施加药剂在洋菜培养基表面的方式，抑菌圈法又分为管碟法（牛津杯法）、滤纸片法、

7、孔碟法,1） 用灭菌蒸馏水将供试药剂配制成一系列梯度浓度，一般57个浓度。 （ 2 ） 制备一定“浓度”的供试菌悬浮液（如真菌，则宜用孢子悬浮液），浓度以在低倍镜（15X10倍）下每视野80一100个左右孢子为宜,管碟法又称牛津杯法,3）待培养基冷至50左右（凭经验估计），迅速吸取10ml菌液加入培养基内，充分混合后，倒入灭菌的培养皿中，制成含菌培养基平板,4）在每皿培养基上按合适的间隔放置6个不锈钢小管（即牛津杯，外径8.0士 0.lmm。内径6.0士0.1mm，高10.0士0.lmm），其中1个管为对照，其余5管为5个不同浓度的药液，在适合的温度下培养一段时间，取出用十字交叉法测是抑菌圈的

8、直径,抑菌圈法示意图,上述操作应尽量在无菌条件下进行，以防污染 操作室的温度最好在2628左右，如室温太低，则50左右的培养基在操作过程中迅速冷凝，无法制作平板 十字交叉法测量抑菌圈的直径 ，消除误差,注意事项,1）配制不同浓度的药液 （2）配孢子悬浮液 （3） 制含孢子的平板,滤纸片法,前三步完全和上述管碟法相同,4）用消毒镊子夹取灭菌的圆形滤纸片（直径为0.6或0.8cm）投入不同浓度药液中，1分钟后取出，放入含真菌孢子的培养基上，每皿放6片（5个浓度各1片，另1片为对照片），恒温培养一定时间，测抑菌圏直径,各滤纸片间距要适合，以防形成的抑菌圈不园 放滤纸片时要平放、更迅速、准确、放下后不

9、能再移动 用十字交叉法测量抑菌圈的直径,注意事项,用灭菌后的打孔器直接在凝固好的含孢培养基上打成圆孔，将定量的药液滴入圆孔中，恒温培后测量抑菌圏的大小，进行杀菌剂毒力比较,孔碟法,主要有以下几个方面的 1对供试菌的要求在较粗放的比较杀菌剂毒力的测定中，对菌种的要求不必过严，只要在培养基中容易培养而且抑菌圈清楚的均可采用,影响抑菌圈法测定结果的因素,特别是为某一特定病害寻求有效的防治药剂时，实际上不可能对供试菌进行选择，但以水平扩散法作生物定量测定，如抗菌素效价测定，则必须对供试菌有如下的要求： 对被测定的药剂有适当的敏感性，抑菌圈界限明显 培养容易，生长迅速不易为杂菌污染不易发生变异 容易作成

10、接种菌液（菌丝体或孢子悬浮液） 菌种有较强的耐热能力,2对药剂的要求 用抑菌圈法测定一种药剂的抑菌作用的大小，有一定的局限性。如与该药剂的理化性质有密切的关系。如是否容易扩散。若有很好的扩散性能，就能真实反映该药剂的杀菌毒力。如由于大多数抗生素都有一定的水溶性，因此，抑菌圈法为抗生素的科研和生产广泛采用。而有相当一部分杀菌剂的原药是不易溶解于水，故扩散性不好，要用该法，就要用适量的乙醇或丙酮溶解后，再用水稀释至所需的浓度。 有效好的水溶性,将不同浓度的药液和热的培养基混合，用这种含毒培养基培育病，以病原菌的生长进度的快慢来判定药剂的毒力大小,2）生长速率法原理,有2种： 菌落达到一定的大小所需

11、时间， 一定时间内菌落的直径大小,病原菌生长的表示方法,优点： 操作比较简单 适用范围广，适用于乳油、水剂、可湿性粉剂等 重复性好。只要操作认真，均可得到可靠的结果,生长速率法的优缺点,缺点： 对供试菌种要求严格，病菌要易于培养，生长较快且边缘整齐、产孢子缓慢，而且是农业生产上重要的的病原菌。 对供试药剂要求，有一定的耐热性，遇热不易分解,苹果腐烂病菌（Valsa mali） 小麦纹枯病菌（Rhzoctonia solani ） 棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium） 葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella） 小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces

12、graminis） 辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici,生长速率法常用的菌种,1）制备菌饼：用无菌的打孔器在供试菌种边缘打下菌块即菌饼（在无菌条件下进行） （2）含毒培养基的制备：奖供试药剂稀释成一系列梯度浓度后，准确取一定量的药液加入到热的培养基中，混匀，倒入灭菌的小培养皿中（直径为6cm），待冷凝后即为含毒培养基,生长速率法,3）移植菌饼用接种针或消毒的摄子将菌饼反面（有菌丝的一面向下和培养基贴合）移植到带毒培养基平板上，一个培养皿最好接一个菌饼。 （4）测定菌落直径恒温培养到预定时间后，取出培养皿测量菌落直径。每个菌落十字交叉测两次直径,生长速率法示意图,菌饼,含药剂

13、的培养基,菌饼,含毒培养基,纯生长量菌落直径菌饼直径 对照的纯生长量处理的生长量 抑制率X100 对照的纯生长量,计算公式,将算出的各处理（浓度）的抑制率换成机率值，以对数表示浓度，用作图法或最小二乘法求出EC50或EC95，并以此比较毒力,毒力方程的计算,在比较粗放的进行几种杀菌剂的毒力比较时，可以采用最低抑制浓度法,3）最低抑制浓度法,最小浓度法基本原理 是药剂按等比或等差级数系列浓度和培养基混合后接入供试菌，定温培养一定时间后，找出“终点”（明显地抑制供试菌生长发育的最高稀释倍数，即最低浓度）的那个浓度，即为最低抑制浓度。通过比较几种不同药剂的最抵抑制浓度即可比较其毒力。显然，最低抑制浓

14、度最小的，其毒力最大,根据培养基是固态还是液态又将最低抑制浓度法分为 液体培养基稀释法 固体培养基稀释法,取若干只灭菌试管，顺序编号，在每只试管中加入适合供试菌生长的液体培养基Nml，然后在第一号试管中加入一定浓度的供试药液Xml，充分混合后自第一管中取Nml放入第二管，充分混合后取Xml加入第3管，直到最后一管不加药液作为对照。自倒数第二管中取出Xml弃去不用，如此所得的一系列浓度顺序相差一倍,液体培养基稀释法,在各管中加入供试菌悬浮液一滴，在该供试菌最适温度下培养一定时间，取出观察“终点”，一般以混浊度为准，即以某编号试管以下不再发生明显混浊现象，这一试管的浓度就是最低抑制浓度,12345

15、CK,用灭菌蒸馏水将供试药制按等比或等差级数稀释一系列药液浓度。分别取每种浓度的药液Xml分放50ml灭菌三角瓶，加入灭菌并冷至60左右的培养基Yml，立即摇匀倒入培养皿内凝固。用接种环沾取供试菌液进行划线培养，至一定时间后观察抑制病菌生长的最高稀释倍数即最低抑制浓度,固体培养基稀释法,接菌饼，若不能生长，此浓度是最低抑制浓度,划线接细菌，不能生长，此浓度为最低抑制浓度,叶碟法比较简易，能在室内进行，比孢子萌发法和含毒介质培养法接近生产实际，可看作是盆栽试验的过渡阶段,3.叶碟法,叶碟法的基本原理是将容易感染供试菌的植物叶片（如蚕豆叶片）经不同浓度的药剂处理后平放在培养皿内，再将一块培养好的供

16、试菌菌丝体（如纹枯病菌）放在叶片上，经保湿培养一定时间，检查其病斑面积，并以此衡量供试药剂的毒力,还有一种叶碟漂浮法，其原理是将容易感染供试菌的植物叶片（如黄瓜叶片）制成直径1.5cm叶碟，漂浮在不同浓度的药液中，将供试菌（如黄瓜霜霉病菌）孢子悬浮液定量滴加在叶碟上，在光照下培养一定时间，调查病斑面积,叶碟漂浮法,四、杀线虫剂的生物测定技术,供试线虫： 番茄根结线虫Meloidogyne incognita 马铃薯茎线虫 Ditylenchus destructor Thorne 但如果是针对某种线虫筛选合适的杀线虫剂，则只能以此种线虫为指示生物,杀线虫剂的生物测定方法 依药剂性质分为两类：

17、（一）非熏蒸剂测定方法 （二）熏蒸剂测定方法,将供试药剂蒸馏水稀释成57个梯度浓度 取上面药液1.5ml加入一个小玻皿（高 1cm直径 2 cm）中 每种浓度重复3皿 对照则加入1.5ml蒸馏水 将分离的供试线虫经清水漂洗后挑入小皿中，皿1520条/皿 将盛有药液和线虫的小皿置于衬有湿滤纸保温的大培养皿中，在2425恒温箱中保持24h或48h后取出，在双目解剖镜下检查线虫的存活情况,非熏蒸剂的生物测定,通常将不能活动的，伸长的线虫或是虫体有着凸凹不平的弯曲部分，内含物为黑色颗粒者，都定为死线虫。 1、触动法 2、染色法,线虫死亡的判断标准,12345CK,死亡线虫数 死亡率X100 供试线虫总

18、数 将浓度取对数值，线虫死亡率转换成机率值，用杀虫剂毒力测定中的方法求出LC50或LC95，并以此来比较毒力大小,计算公式,以熏蒸作用为主的杀线虫剂的毒力测定和杀虫剂的情形相似。 在0.33L熏蒸瓶壁上贴一滤纸，瓶底放一小玻皿（高1cm，直径2 cm），皿中注入蒸馏水，使水位高2mm左右，放入1520条供试线虫，同时在瓶底放一滤纸片（1X 3mm），用微量注射器将供试药剂病加在滤纸上。测定要求设5个浓度，加二溴氯丙烷，可设置100、50、25、12、6mgL和不给药对照，重复3次。2425下熏蒸24h，检查线虫死亡率,二）熏蒸剂的毒力测定,线虫,滤纸片,五、杀菌剂盆栽试验,药剂（杀菌剂,病原菌

19、,室内生测示意图,寄主植物,杀菌剂,病原菌,杀菌剂盆栽药效试验,利用盆、钵培育幼嫩植物进行生物测定，是研究杀菌剂的有效方法之一。盆栽试验法克服了在离体条件下对病菌无效而在活体条件下有效的化合物的漏筛。同时，盆栽试验法更接近于大田实际情况，所得资料对指导生产实际有较高的参考价值。此外，盆栽试验所用材料易得，条件易于控制，在当前的杀菌剂研究中，越来越重视盆栽试验法，有些公司在进行活性筛选时甚至只用盆栽试验法，而淘汰了离体试验法,1和大田药效试验相比，供试菌的培养不受自然条件限制，可较快得出结果，可用作大量化合物的活性筛选 2多种条件易于控制，测定结果比较稳定可靠 3接近大田实际情况，其结果对生产实

20、践有较大的参考价值。 其不足之处是：和室内生测方法相比，由于有寄主植物参与，测定工作比较麻烦而且测定周期比较长,室内盆栽毒力测定的优点,对供试植物的要求： 容易栽培 生长迅速 是主要农作物 如水稻、小麦、黄瓜、棉花、番茄等等,供试植物,供试病菌基本上是由供试植物决定的。如供试植物是水稻，就用水稻主要病害（如水稻稻瘟病，水稻纹枯病）的病原菌；若供试植物是小麦，就用小麦主要病害（全蚀、赤霉、锈病、白粉、病毒病）；供试植物是玉米，就用玉米主要病（大小斑病,供试病菌,影响杀菌剂盆栽的因素,植物的抗病性 病原菌的致病力 环境条件（主要是温湿度,植物的抗病性,供试植物应选感病品种或者中抗品种，不能选种抗病

21、性品种或免疫品种,供试菌种的致病力，是盆栽试验成功与失败的主要因素。病原菌的致病力不是固定不变的性状。 在同一病原菌中，有致病力强弱不同的菌系和小种。 病原菌的致病性与其生理、生化及其他生物学特性有密切关系，在适应新的环境的同时，病原菌可以改变其致病性。如用高粱粒培养的水稻稻瘟病菌孢子和采自田间的感病稻茎节经保湿后产生的孢子，其致病力相差较大，一般情况下，后者的致病力较强。即使同是人工培养基产生的孢子，因培养基配方不同，培养条件不同，其孢子的致病能力也不同，这些都应加以注意,病原菌的致病力,环境条件,温度 湿度 光照,病害的传播方式不同，接菌方法也不同。 必须首先了解要接种的病原菌的主要传播方

22、式和侵染途径。 气流及雨水传播的病害可用喷雾法或喷粉法接菌。如病菌主要由气孔侵入，接菌时应注意在叶背面接菌。喷雾法接菌一般是将孢子悬浮液喷在植物表面，为了使孢子在悬浮液中均匀分散，可适当加入湿润剂，这不但有利于孢子分散，而且也有利于悬浮液在植株上附着。如果孢子在悬浮液中分散不匀，植株发病后有些叶片可能病斑连成一片，有些叶片则没有或很少有病班，给病情调查带来困难和误差，孢子悬浮液中孢子的密度以及是否加入粘着剂对发病影响很大。以稻瘟病菌的接菌为例，稻瘟病菌孢子以在低倍镜下（10 X 15）每视野100个孢子为宜，在孢子悬浮液中加入0.25的明胶作粘着剂也会收到良好效果,主要的接种方法,喷雾接菌最好

23、用特制的喷雾装置。粗放一点的工作也可用家庭卫生用小型手持喷雾器。 接种锈菌和白粉菌时，可先在小麦植株上喷水，以造成在叶片上有水膜，然后用滑石粉将孢子粉稀释，采用喷粉装置接菌。 水稻纹枯病菌可在栽种水稻的盆水中接种菌核，但更多的是用其菌丝块夹在稻茎基部叶鞘上。 水稻白叶枯病菌常采用针刺接菌，或剪去部分稻叶，造成人工伤口，再喷白叶枯病菌细菌）悬浮液接菌,接种方法,由种子传染的病害可用病菌孢子拌种或孢子悬浮液浸种法进行接菌；而土壤传染病害则可将病原菌拌入土壤中接种或将植物根部浸入孢子悬浮液中进行接种,接种方法,环境条件不但影响供试植物的正常生长，更重要的是影响接菌的成败。为创造有利于病菌入侵的条件，应十分注意对环境因子如光照、温度、湿度等的控制,发病的环境因子,在设备良好的研究所或公司，拥有现代化温室，或人工气候室，光照及温、湿度可随意调节；但在基层研究单位，条件较差，环境因子的控制就不那么容易。如果没有专门的温室，试验应安排在自然条件下供试病菌发生的季节进行，以满足对温度的要求。湿度的控制比温度更重要，只有满足病菌对湿度的要求，病菌才能萌发生长,环境条件,光照一般对孢子萌发入侵不利，但寄主植物却要在光照下才能正常生长。如利用自然光，最好在下午太阳落山后接菌，这样，经过一个晚上，大多数病菌孢子可以萌发入侵,光照,盆栽试验应采用比较精密的喷雾或喷粉装置，定量喷洒供试药