基因扩增技术PCR

1、Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应,PCR,Polymerase,chain,reaction,又称无细胞分,子克隆系统或特异性,DNA,序列体外引物,定向酶促扩增法，在,模板,DNA,引物,模板两端的已知序列）和,四种脱氧核,苷酸,存在的情况下,DNA,聚合酶依赖的,酶促合成反应,PCR,的定义,PCR,技术是由,Cetus,公司和加利福利亚大,学,1985,年联合创造的，主要贡献者为,Kary,B,mulis,和,HeneryA,Erlich,可将极微量,的靶,DNA,特异地,扩增上百万倍，能检测,每,10,万个细胞,中仅含,一个,靶,DNA,分子,的,样品。

2、因而发明人,Kary,B,mulis,获,1993,年诺贝尔化学奖,1993,年获诺贝尔化学奖,PCR,的种类,RT-PCR,反向,PCR,不对称,PCR,多重,PCR,巢式,RT-PCR,实时定量荧光,PCR,PCR,温度循环参数,变性,denature,温度和时间,模板,DNA,的变性：模板,DNA,双链在,93-96,加热,2,10,解离；经,PCR,扩增形成的双链,DNA,在,93-96,C,加热,30,1,退火,anneal,温度和时间,Tm-5,C,温,度,降,至,5,5,C,左,右,特,异,引,物,与,模,板,D,N,A,单,链,配,对,结,合,延伸,extend,温度和时间,7

3、2,C 1000,碱基,分钟,在,TagDNA,聚合酶的作用下，以,dNTP,为反应原料，靶序列为模,板，引物为起始点，按碱基配对原理合成一条新的复制链,循环数,在,2530,个循环内，扩增的,DNA,量增加明显，然后进入平台期,靶序列的初始浓度越低，所需循环数越高,PCR,扩增效率（理论,以上三步为一个循环。每一循环的产物可以,作为下一个循环的模板，从理论上讲，每经,过一循环，样本中的,DNA,量应该增加一倍,扩增,DNA,产量是以指数形式上升的，既,n,个,循环后，产量为,2,n,经过,25-30,个循环后,DNA,可扩增,10,6,10,9,倍,PCR,扩增效率（实际,实际上,PCR,扩

4、增效率比理论值要低。对于不同的基因来,说，扩增效率也大不相同,如图所示,经过一定循环数之后,PCR,产物的量增长缓慢，进入所谓的,平台期,，在,PCR,扩增反应达到平台期前，模板扩增产物,N,与启始模板,N0,之间呈下列方程所示关系,N = N0,1+E) n,其中,E,是扩增效率,n,是循环数,演示,PCR,反应的过程,PCR,反应体系组成,1,DNA,模板,2,引物,3,dNTP,4,耐热的,DNA,聚合酶,5,10,PCR,缓冲液,含,Mg,模板核酸,PCR,可以以,DNA,或,RNA,为模板进行核酸的,体外扩增,RNA,的扩增必须经逆转录成,cDNA,后才能进,行正常的,PCR,循环，

5、称为,RT-PCR,PCR,反应中模板加入量一般为,10,2,10,5,个拷贝,的靶序列,人工合成的寡核苷酸,引物,PCR,扩增产物的,特异性,和扩增,片段的大,小,是由引物限定的，因此，引物的设,计对,PCR,的成功与否有决定性的意义,引物设计原则,软件,经验,引物长度以,15-30,个碱基为宜,引物碱基尽可能随机分布,G+C,含量宜在,4555,左右,引物内部不应形成二级结构,两个引物之间不应形成二级结构,引物与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性,两个引物的,Tm,值要尽可能接近,一,般,PCR,反,应,中,引,物,的,终,浓,度,为,0.1,1,mol/L,在此范围内产物量基本相同,引

6、物浓度,低于,0.1,mol/L,时，产物量降低,引物浓度过高会引导非特异产物扩增,还会增加引物二聚体的形成,引物浓度对,PCR,反应的影响,合适的缓冲体系,目,前,最,常,见,的,缓,冲,体,系,为,1050mmol/L,Tris,HCl(pH,8.3-8.8,20,Tris,是一种双极性离子缓,冲液，其主要作用是维持,碱性,的,Taq,酶作用环境,在缓冲液中加入,明胶,或无核酸酶的,BSA,对酶有,一,定,的,保,护,作,用,Tween-20,0.05%-0.1,及,5mmol/L,的二硫苏糖醇,DTT,也有类似作用。尤,其在扩增长片段（延伸时间长）时，加入这些酶,保护剂对,PCR,反应是

7、有利的,Mg,2,Mg,2,是,TaqDNA,聚合酶活性所必需的,Mg,2,浓度直接影,响着酶的活性与忠实性、引物的退火、模板与,PCR,产物,的解链温度、产物的特异性以及引物二聚体的形成等等,因为,PCR,反应混合物中的,DNA,模板、引物和,dNTPs,的,磷酸基团均可与,Mg2,结合，降低,Mg2,的实际浓度,Taq,DNA,聚合酶需要的是游离的,Mg2,因此,PCR,中,的,Mg2,的加入量要比,dNTPs,的浓度要高,0.2-2.5mmol/L,最,好,对,每,种,模,板,D,N,A,每,种,引,物,都,进,行,Mg2,浓度的优化,三磷酸脱氧核苷,dNTPs,四种三磷酸脱氧核苷,dA

8、TP,dCTP,dGTP,dTTP,是,DNA,合成的基本原料，工作浓度应为,20200,mmol/L,所用的四种,dNTP,的浓度应相,等，以使错误掺入率降至最低,dNTPs,浓度过低,则反应速度下降,dNTPs,浓度过高则扩增特异性,降低,而且当,dNTP,浓度高于,50mM,时也会抑制,Taq DNA,聚合酶的活性,耐热,DNA,聚合酶,Taq,聚合酶是从耐热菌,thermus aquatious,中提取出来的耐热酶,95,仍有活性。该,酶的应用浓度一般为,12.5U/100,L,反应体,系，然而，酶的用量可依据不同的模板分,子或引物而变化,酶浓度过高时,会出现,非特异性扩增,过低时扩增

9、产物量很低,试剂,原液浓度,工作浓度,50,l,体系,PCR,缓冲液,10,1,5,L,上游引物,50,mol/L,0.5,mol/L,0.5,L,下游引物,50,mol/L,0.5,mol/L,0.5,L,dNTPs,10mmol/L,200,mol/L,4,L,MgCl,2,25mmol/L,1.5mmol/L,1.5,L,Taq,酶,5U,L,2.5U/100,L,体系,0.25,L,DNA,模板,10,2,10,5,拷贝,ddH,2,O,补足,50,L,PCR,混合液,PCR,产物的分析,半定量,RT-PCR,原理,持家基因,在所有类型组织和细胞中普遍表达恒定的基因,如,2,微,球,蛋

10、,白,肌,动,蛋,白,和,G,A,P,D,H,基,因,在逆转录过程中，“持家基因”的,mRNA,与待测模板的,mRNA,共同逆转录为,cDNA,因此排除了,cDNA,合成效率不,同所引起的误差。在此后的,PCR,反应过程中，“持家基因,的,cDNA,与待测模板,cDNA,用不同的两对引物在同一,PCR,体,系内扩增。待测模板扩增产物与该样品“持家基因”扩增,产,物,的,比,值可以反映待测模板表达量的相对高低,持家基因选择的原则,在欲分析的组织或样品中该持家基因的表达稳定,RNA,特异性的检测，注意假基因的干扰,持家基因的拷贝数和预测基因的拷贝数在同一线,性范围内,常用持家基因表达的稳定性,常用

11、持家基因在基因组序列中存在假基因情况,不同类型细胞中持家基因表达的稳定性,Vandesompele, J., K. De Preter, et al. Genome Biol, 2002,不同类型组织中持家基因表达的稳定性,de Kok, J. B., R. W. Roelofs, et al. Lab Invest,2005,在前列腺癌组织中一些持家基因表达的稳定性,Fig. Selection of the most suitable reference genes for normalization in prostate cancer samples,using geNorm anal

12、ysis by calculating the average expression stability measure M, and the least,stable gene with the highest M value,Ohl, F, M. Jung, et al. J Mol Med, 2005,PCR,产物的分析,如何调整,PCR,产物在直线期,一管,PCR,法（减少持家基因引物量,两管,PCR,法（同一混合液，同一,PCR,程序,如何调整不同样品间持家基因的差异,RNA,水平调整（加大模板量,cDNA,水平调整（加大模板量，最多,2uL,电泳水平,持家基因与欲测基因体积一致,待

13、测模板的相对含量,样品荧,光强度,内参照模板的荧光强度,RT-PCR,实验的策略,1,热启动,Taq,酶在低温下仍有活性，故,PCR,混合物在显著低于,Tm,值,的温度下,Taq,酶可催化引物与模板的非特异复性或引物,二聚体的形成,在第一个循环的变性温度加入,Taq,酶,将,含,有,M,g,2,的,石,蜡,珠,放,在,管,内,待,达,到,变,性,温,度,时，石蜡熔化,Mg2,进入反应液中，起始反应,在,PCR,反应液中，加入,Taq,酶的单克隆抗体，在温度升高到,将中和抗体变性失活之前,抗体与,Taq,酶结合，使其不,能发挥作用,RT-PCR,实验的策略,2,优化,Mg2,浓度,应用不包含,M

14、g2,的,PCR,缓冲液，将,10mmol/L,M,g,C,l,2,贮,存,液,逐,一,加,入,反,应,管,中,开,始,以,0.5mmol/L,递增,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3mmol/L,，在确定了,Mg2,大概浓度后，再在,该浓度上下，以,0.2mmol/L,递增和递减几个浓度,来精确确定,Mg2,的最合适的浓度,RT-PCR,实验的策略,3,退火温度和时间,Tm=4(G+C)+2(A+T,简单计算法,从退火温度低于,Tm,值,5C,开始，由低往高优化,欲增加,DNA,扩增产物，可在前,5,个循环增加退火,时间，如,2,分钟，其次的循环中退火时间为,1,分,钟,4,缩短合成

15、时间（适用于非特异大片段,RT-PCR,实验的策略,5,模板中,G+C,比例过高,可加,1-10,二甲基亚砜,DMSO,，使模板,易于解链和引物特异性的结合,6,若不出,DNA,扩增带，用持家基因引物做,PCR,首先排除模板问题，在依次寻找其它原因,引物不特异、退火温度过高,Mg2,浓度不,合适或试剂出现问题等,7,对很难扩增的片段可考虑用下游引物反转录,8,对长片段的策略,RT-PCR,实验的策略,PCR,污染的对策,1,隔离不同的实验操作区，将提取,RNA,操作区、引物,分装区,PCR,操作区及,PCR,产物分析区分开,2,分装试剂，把试剂分装成小份，在冰箱中保存。目的,是为了减少重复取样

16、所造成的污染,3,改进实验操作，实验时戴一次性手套，加样中要避免,反应液的飞溅。在操作多份样品时，要制备标准混合,液，将各组分混匀后再分到不同的管，这样可以减少,操作污染，并且提高微量加样的精确度,PCR,污染的对策,4,设置对照,阳性对照：用已知的阳性模板,阴性对照：加无关的或不加模板,DNA,重复实验：为防止因各种原因引起的实,验,误差，应进行反复验证,以确,保实验结果的重演性,污染的处理,酸处理：用,1M,的稀盐酸擦拭或浸泡污染器,件，可促进,DNA,脱嘌呤,紫外灯照射,UV,波长一般选择,254/300,nm,照射,30,分钟即可。紫外照射可促使,DNA,形成,二聚体，阻止链的延伸。紫

17、外照射对长片段,的,DNA,有效，对短片段效果不大,巢式,PCR(nested PCR,对于极微量的靶序列，一次扩增很难取得满意的效果，则可,用巢式,PCR,进行多次扩增。引物之间的关系如下图所示,引物,1,和引物,4,进行第一次扩增，其产物作为模板，用引物,2,和,3,作为再次,PCR,的引物。如果一次,PCR,产物在凝胶上有可见,的条带，二次,PCR,只能用第一次,PCR,产物的,1/10,4,10,5,为模板,实时定量荧光,PCR,实时,PCR,real time PCR,是,1996,年以来发展起来的一种,新技术,1,荧光定量,PCR,技术的整个操作过程在完全封闭的状态下进,行，有效的

18、避免了“假阳性”的实验结果,2,荧光探针的使用提高了检测灵敏度和特异性，并能够准确,定量样品的,模板数,3,PCR,扩增后不需进行电泳等后处理，而直接定量样品模板,数，使其具有分析时间短，重复性好、省力、低费用等优,点,TaqMan,探针,A,TaqMan,探针同时带有荧光,报道子和淬灭子，无荧光信,号发生,B,在退火阶段，引物和探针同,时与模板结合,C,在延伸阶段,Tag,酶将探针,水解，报道子被切割，使得,荧光信号释放，荧光信号的,强弱与模板的量成正比,荧光染料掺入法,某些染料能够特异性地结合到,双链,DNA,上，而不结合到单链,DNA,上,而且与双链,DNA,结合后的染料发光强度会明显增

19、加，检测结合到双链,DNA,上的荧光染料发出的荧光可,实时监测,PCR,扩增产物的数量,SYBR Green I,是一种结合于,DNA,双螺旋,小沟,中的荧光染料。其最大吸收波长,约为,497nm,最大发射波长约为,520nm,优点,1,由于它与所有的双链,DNA,相结合，不因模板不同而特别定制通用性好,且价格相对较低,2,由于一个,PCR,产物可以与多分子的染料结合，因此其灵敏度很高,缺点,1,由于,SYBR Green I,与所有的双链,DNA,相结合，引物二聚体、单链二级结,构以及非特异扩增产物可引起假阳性。因此，只限于分析特异性扩增产物,可用溶解曲线分析产物的特异性）染料可影响扩增效率

20、,实时定量,PCR,的,Ct,值概念,Ct,值是实时定量,PCR,技术中进行定量的一个,重要参数,阈值,是显著大于背景信号的荧光信号值,它总是出现在扩增的指数期,达到荧光阈值所需的,最小循环数,为,Ct,值,在反应的起始，模板数越多，达到荧光信,号阈值所需的循环数越少,实时定量,PCR,检测前列腺基质细胞中,GAPDH,和,TGFb1,表达的荧光曲线图,SYBR Green I,掺入法,实时定量,PCR,检测前列腺基质细胞中,GAPDH,和,TGFb1,表达的,熔解曲线图,单一峰表明产物是单一的，无非特异扩增,实时定量,PCR,检测前列腺基质细胞中,TGFb1,的表达,Well,Gene,Ct,Ct,Ct,2,Ct,control,GAPDH,13.993,7.830,0,1,