实验报告 植物基因组的提取和检测

1、 四川大学实验报告 题目：的提取与检测植物基因组DNA一、实验目的 1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理； 2.掌握基因组DNA提取的方法和步骤。 二、实验原理 1.在液氮中对植物组织进行研磨，破碎细胞； 2.SDS等离子型表面活性剂能溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来； 3.苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质； 4.上清液中加入异丙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE缓冲液中，即得植物基因组DNA溶； 5.DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA

2、的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。 三、实验材料 1.设备 移液器，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5ml离心管 2.材料 植物幼嫩叶片 3.试剂 （1）细胞提取液：100mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 5mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.25% SDS，1%-巯基乙醇（去除酚类） （2）氯仿:异戊醇（24:1） （3）其它试剂：液氮、无水乙醇、 TE缓冲液、异丙醇、洗涤

3、缓冲液 四、方法和步骤 0C水浴（金属浴）中加热备用； 500L细胞提取液于651、取2、研钵用液氮预冷，新鲜植物叶片（自来水清洗，蒸馏水冲洗干），去除叶脉，剪成细条状，置于研钵中研磨成粉末状（越细越好）； 0C预热的细胞提取液中，迅速摇匀，65500、取0.1g粉末（大约两勺半）转移至L3水浴（金属浴）中保温30min，10min左右温和颠倒混匀一次； 第 1 页 四川大学实验报告 题目： 的提取与检测植物基因组DNA4、从水浴（金属浴）中取出离心管，加等体积(约500L)氯仿/异戊醇（24:1），室温下10000rpm10min； 5.将上清液转移到另一1.5mL离心管中（使用的枪头用剪刀

4、剪成大口），加等2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，静置1min,使核酸沉淀下来，12000r/min 5min，倒掉上清液； 6、加入1ml洗涤缓冲液，轻轻转动离心管使核酸沉淀悬浮起来，静置5min,12000r/min 2min,去除上清液，再加入1ml洗涤缓冲液，轻轻转动离心管使核酸沉淀悬浮起来，放置5min; 7、12000r/min 10min后，倒去上清液，用小滤纸条将管壁上多余的水分吸掉，室温静置干燥； 8、干燥后，加入20LTE缓冲液，溶解DNA，做好标记； 9、取5L溶液，0.7%琼脂糖凝胶电泳检测DNA大小和质量。MarkerDNA为DL15000。 五、注意事项 （一）提取DN

5、A的过程： 1.DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件； 2.抑制内外源Dnase的活力。Dnase就像一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a.低温操作；b.调节pH,使偏碱2+）Mg,加螯合剂（EDTA）除去酶的辅助因子（pH8.0);c.（抽提液中加表明活性剂；d.使酶活性丧失； 3.防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽提过程中要

6、特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动； 4.植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用。因此，一般进可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料，这是因为幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，切易于破碎，植物材料最好是新鲜的。 （二）琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA： 1.EB为诱变剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作； 2.将溶液加入样品槽时，勿划破或戳破加样孔，勿带入气泡； 3.紫外线对眼睛有害，将胶块置于紫外灯下观察时，带上防护镜或眼睛，或隔着玻璃或 有机玻璃观察。六、实验结果与分析 1.植物基因组DNA提取结果

7、： 页 2 第 Marker:TM DL1500150010007505002501000 250 普通灯光下的观察结果1 实验结果分析： 图、个为715000bp、10000bp泳道的I.Marker带： MMarker与预期结果相符合，出现 条带，但是出现拖带现象；、7500bp、5000bp2500bp、1000bp250bp个条带，均出现拖带现象，其中第二条带和第II.泳道1号3：植物基因组DNA跑出了 三条带拖带较严重； 第一条带位于点样孔下方，亮度较小，可能是提取过程中出现的杂质；表明提取的较成功；DNA是提取的植物基因组，亮度较小，15000bp第二条带位于附近， 250bp第三

8、条带位于的下方，亮度大，是提取过程中的杂质； 页 3第 紫外灯下的观察结果2 图 四川大学实验报告 题目： 的提取与检测植物基因组DNA七、讨论 1.实验方法比较： 由于植物中的次生代谢产物-多酚类化合物可介导DNA降解，而多糖的污染也是影响植物核酸纯度最常见的问题，这些多糖能抑制限制酶、连接酶及DNA聚合酶等分子生物学酶类的生物活性。传统的CTAB-DNA提取法步骤多，较繁琐，DNA产率低，而且由于酚很难完全去除，容易影响以后的酶切等工作的效率。SDS法操作简单，温和，也可提取到较高分子量DNA，但所得产物含糖类杂志较多，这将直接影响DNA的限制性核酸内切酶酶切效果。由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类）对DNA的抽提产生不利影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。 2.植物研磨操作，一定是研磨，不是用力捶！提取基因组过程有很多操作需要温和